近日，宾夕法尼亚大学Perelman医学院的研究人员在《自然生物技术》（Nature Biotechnology）杂志上发表了一项重要研究成果。他们首次利用病毒载体传递CRISPR基因编辑元件，成功纠正了患有遗传疾病的新生小鼠模型中的致病突变，改善了其生存率。然而，令人意外的是，同样的治疗方法在成年小鼠中却导致了病情恶化。

该研究的资深作者、Perelman医学院医学教授及罕见病中心主任James Wilson博士指出：“在出生后纠正动物模型中的致病突变，使我们向实现个体化医疗的潜力迈进了一步。但长达35年的基因治疗研究生涯让我深知，将小鼠研究转化为成功的人类治疗有多么困难。目前，我们正在调控这一基因编辑系统，以解决成年动物中出现的意外并发症。”

研究团队在由鸟氨酸氨甲酰基转移酶（OTC）缺陷引起的尿素循环障碍疾病动物模型中进行了实验。OTC缺陷是最常见的尿素循环障碍疾病，每4万个新生儿中就有1人患病。突变OTC基因编码的酶比正常酶短、形状错误，甚至可能完全不生成蛋白。由于该突变发生在X染色体上，女性通常是携带者，而男性后代则会患病。

研究小组将两个腺相关病毒（AAV，具体为对肝细胞有亲和力的AAV8血清型）注入新生OTC缺陷小鼠体内：一个AAV表达Cas9蛋白，另一个表达导向RNA和供体DNA。表达Cas9的AAV通过肝脏特异性启动子，确保只在肝细胞中表达。另一个AAV传递导向RNA，并包含纠正突变的供体DNA模板，使细胞能够生成正常的OTC蛋白。整个系统发挥“剪切和粘贴”功能，最后的“粘贴”阶段依赖细胞自身的DNA修复机制来正确连接OTC基因。

在新生小鼠中，该AAV系统在10%的肝细胞中纠正了突变，并提高了高蛋白饮食挑战下的存活率。相比之下，超过30%的未治疗OTC缺陷小鼠在一周后死亡，其氨水平显著高于基因纠正的小鼠。深度测序也证实了突变纠正与生存结果的一致性。

然而，在8-10周龄的成年OTC缺陷小鼠中，使用相同的双AAV系统进行基因校正的效率要低得多。这些成年小鼠在正常饮食下表现出蛋白质耐量降低和致命的高血氨症。3周后，接受低剂量基因校正治疗的成年小鼠开始死亡，而接受高剂量治疗的小鼠在注射后9天也开始死亡，这与预期相反。

论文共同第一作者、病理学与实验医学研究副教授Lili Wang博士解释道：“我们对这些结果感到惊讶。通过进一步研究，我们阐明了基因编辑加重成年动物病情的机制。”检测成年小鼠肝细胞中的DNA序列发现，具有校正功能的细胞比例仅为1%。“这肯定不足以帮助这些成年小鼠，”Wang指出。更严重的是，许多未校正的基因包含大片段缺失，消除了突变OTC基因的残余活性。

纠正基因的第一步是在供体DNA存在下，通过Cas9在突变附近造成DNA断裂（切割），为同源介导修复（HDR）创造条件。“相比于成体肝细胞，HDR在新生肝细胞中更有效，”Wilson说。在缺乏HDR的情况下，细胞会利用非同源末端连接（NHEJ）过程修复切割。研究小组发现，在成体肝细胞中，NHEJ造成了更大的片段缺失，其中一些消除了OTC基因的残存功能。

目前，该研究小组正在探索在不引发大片段缺失的情况下进行切割，并提高粘贴效率的方法，以避免在成年肝病患者中出现上述问题。去年3月，Whitehead研究所的研究人员曾提出通过抑制NHEJ来完善CRISPR/Cas系统，他们在对受精卵进行基因编辑时使用了抗癌药物Scr7，该药物能结合DNA连接酶I，阻断NHEJ修复通路，将CRISPR/Cas的效率提高了19倍。此外，在今天的《自然生物技术》杂志上，麻省理工学院的研究人员也报道了一种安全、高效利用CRISPR治疗疾病的方法。