第三节　DNA重组实验中常用的技术

　　一、质粒DNA的提取及鉴定

　　（一）质粒DNA的提取及鉴定

　　1．收获细菌

　　（1）将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中，接入一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。

　　（2）将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，用台式离心机于4℃以12000g离心5min，将剩余的培养物贮存于4℃。

　　（3）吸尽培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。

　　2．碱裂解法小量抽提质粒

　　（1）将细菌沉淀[上述步骤（3）所得]重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/l Tris –HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA）中，剧烈振荡。

　　（2）加200μl新配制的溶液Ⅱ（0.2mol/l NaOH, 1%SDS），缓和振荡，水浴5min。

　　（3）加150μl预冷溶液Ⅲ（50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml），缓和振荡，冰浴5min。

　　（4）4℃以12000g离心5min，将上清转移到另一离心管中。

　　（5）可作不可作：加等量饱和酚，氯仿，振荡混匀，重复2，（4）。

　　（6）用2倍体积无水乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合，于室温放置2min。

　　（7）4℃以12000g离心5min。

　　（8）小心吸尽上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，再将附于管壁的液滴除尽。

　　（9）用75%乙醇于4℃洗涤DNA，同上离心去上清真空抽干。

　　（10）加50μl的1×TE（含20μg/ml无DNA酶的胰RNA酶），振荡，贮存于-20℃。

　　（二）质粒DNA的大量制备

　　（1）同上1.（1）

　　（2）将1ml含菌液倒入含相应抗生素的Lb 100ml中，37℃振荡培养至A₅₉₀=1.0(5～6h)。

　　（3）加氯霉素（170μg/ml）扩增，37℃温箱中培养过夜。

　　（4）收集菌液于离心管中，冰浴10min。3000rpm,离心10min，去上清。

　　（5）加溶液Ⅰ5ml悬浮菌体，将悬液倒入高速离心管中，摇匀，冰浴5min。

　　（6）加溶液Ⅱ10ml轻轻混匀，室温下5min。

　　（7）加溶液Ⅲ7.5ml轻轻混匀，冰浴30min。15000rpm，4℃离心20min。

　　（8）取上清液于高速离心管中，加2倍体积的无水乙醇，混匀，入-20℃3～5h。

　　（9）15000rpm 4℃ 离心20min。

　　（10）弃上清，将离心管倒放入真空泵中抽干（10～15min）。

　　（11）用5ml1×TE溶解，加入RNase A 15～20μl，42℃水浴4h于过夜。

　　（12）加入5ml饱和酚，混匀，4000～5000rpm离心5min，取上清液入5ml离心管内。

　　（13）分别加入2.5ml饱和酚，2.5ml氯仿，混匀后同样离心收集上清。

　　（14）加等体积氯仿/异戊醇（24：1）混匀，同样离心收集上清。

　　（15）加入1/10体积的3mol/l NaAc及2倍体积的无水乙醇于-20℃3～5h。

　　（16）10000rpm 4℃离心20min。

　　（17）弃上清，加入75%乙醇洗涤2次。

　　（18）离心弃上清，真空抽干，加入适量1×TE溶解质粒DNA。

　　（三）质粒DNA的鉴定

　　1．酶切反应

　　（1）在0.5ml Eppendorf管中加重蒸水6μl，10×Buffer 1μl，DNA 2μl，酶1μl，混匀，37℃水浴1h以上。

　　（2）取反应物点样，观察酶切效果。

　　（3）酶切完全后，70℃5min终止反应。

　　2．琼脂糖电泳

　　（1）配制所需浓度琼脂糖凝胶。

　　（2）在待测的DNA样品中加1/5体积的溴酚蓝指示剂，混匀后点样。

　　（3）打开电源开关，5V/cm电泳。

　　（4）在UV灯下观察电泳结果。

　　二、DNA的重组

　　（一）DNA的酶切与连接

　　（1）酶切反应

　　同质粒DNA的鉴定，只不过是质粒DNA换为载体DNA。若大量酶切，则成比例增加。

　　（2）加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀，-20℃2h以上。

　　（3）15000rpm离心15min，弃上清。

　　（4）加入75%乙醇洗涤2次，离心弃上清，真空抽干。

　　（5）加入适量1×TE溶解。如此可得线性化载体DNA。

　　（6）测定DNA的含量。

　　（7）加入线性载体DNA和含量3～4倍于载体的待插入DNA片段，连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20μl，在12～14℃反应12～16h。

　　（8）连接反应液可置-20℃保存，供转化用。

　　（9）关于待插入DNA片段的获得参见附注。

　　（二）大肠杆菌感受态的制备及重组DNA的转化

　　1．感受态的制备

　　（1）接种单菌落于2ml LB培养液中， 37℃过夜。

　　（2）取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中，37℃振摇4～6h至A₅₉₀=0.4～0.6。

　　（3）倒入50ml管内，水浴10min，以2500～3000rpm离心5min，弃上清。

　　（4）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl₂5ml悬浮菌体，冰浴20min，同上离心弃上清。

　　（5）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl₂1.0ml轻轻混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。

　　2．重组DNA的转化

　　（1）将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记，然后按下述进行：

　　（2）冰浴30min至1h。中间摇动3次，以防受体菌沉底。

　　（3）42℃90s。

　　（4）37℃水浴5min。

　　（5）加入无相应抗生素的Lb 200μl，混匀后，37℃水浴30～60min。

　　（6）分别取3组反应物各50μl在含相应抗生素的固体LB培养基平皿上涂布，室温下干燥，然后倒置于37℃温箱中培养过夜。

　　（三）转化子DNA的快速鉴定－快速细胞破碎法

　　（1）挑取转化平板上的单菌接种于含相应抗生素的2ml LB中，37℃振荡培养至A₅₉₀值为0.6～0.8。

　　（2）取1ml菌液至1.5ml Eppendorf管中，9000rpm离心9min，去尽上清。

　　（3）加入70μl Cracking Gel缓冲液[1mol/L Tris –HCl(pH6.8)10ml,20%SDS 10ml, 250mmol/L EDTA 1.6ml,蔗糖27.2g, 1.2%溴酚蓝1.67ml，加双蒸水至200ml]，混匀后，37℃水浴30min以上。

　　（4）15000rpm离心15min。

　　（5）吸取上清点样电泳，观察。

　　（四）转化子DNA的酶切鉴定

　　1．转化子DNA的快速少量抽提

　　（1）同本节　二.（三）.1.

　　（2）菌液移至5ml Eppendorf 管中，9000rpm,离心9min，去上清。

　　（3）加溶液Ⅰ100μl，溶液Ⅱ200μl，溶液Ⅲ150μl，混匀，冰浴10min。

　　（4）15000rpm离心15min。

　　（5）吸取上清，加入异丙醇1ml混匀，置室温15～30min。

　　（6）15000rpm离心15min，弃上清，加入75%乙醇洗涤2次。

　　（7）离心弃上清，真空抽干，加入适量1×TE溶解DNA。

　　（8）取少量DNA电泳，观察浓度。

　　2．转化子DNA的小量酶切鉴定　　同质粒DNA的小量酶切鉴定，见本节　一（三）。

　　（五）重组子DNA的进一步鉴定

　　可用Southern印迹杂交法或斑点杂交法等进一步鉴定，详见本节　四。

　　[附]电泳洗脱法回收酶切DNA片段

　　（1）用合适的酶切割DNA并电泳。

　　（2）于紫外灯下从凝胶上切下所要的DNA带，装入含1×TBE缓冲液的透析代内，用夹子封好袋口，并检查有无漏孔。

　　（3）将透析袋（纵长）与两极间的边线垂直放于电泳槽内电泳，4～5V/cm电泳至DNA贴紧袋壁。

　　（4）取出透析袋，挤出凝胶块，吸出袋内液体放入1.5ml的离心管内，10000rpm离心5min。

　　（5）吸出上清放入离心管内，加入等体积的饱和酚和等体积的氯仿，振荡混匀，10000rpm离心5min，吸出上清放入新的离心管内。

　　（6）加入1/10体积的3mol/L AaAc,2倍体积预冷的无水乙醇，于-20℃放置4～5h。

　　（7）于4℃，10000rpm离心15min，弃上清。

　　（8）用75%的酒精洗涤2次，每次均于4℃，10000rpm离心5min，弃上清。

　　（9）真空抽干，并用适量1×TE溶解沉淀。如此即得所需DNA片段。

　　三、地高辛配基随机标记DNA探针法

　　（一）概述

　　基因诊断是以核酸分子杂交技术为基础，在核酸水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷和一些传染病病原体的方法。其基本过程是：制备DNA探针，标记探针，检测样本。开展这项工作的关键是要得到高灵敏度、高特异性的探针。以往人们是用放射性同位素来标记探针DNA。近年来，非同位素标记方法发展很快，已有取代同位素标记法的趋势。地高辛配基随机标记DNA探针法，是较为成功的一种非同位素标记方法。其原理是：用化学方法把类固醇类半抗原地高辛分子连接在dUTP上（Dig-dUTP）。用随机引物及DNA多聚酶，以探针DNA为模板，合成互补DNA，化学修饰过的dUTP同时掺入到标记的DNA探针中。杂交后用碱性磷酸酶标记的抗地高辛单抗与标记探针DNA中的Dig-dUTP结合，加入显色底物，在碱性磷酸酶作用下，转变成深棕色或蓝色的化合物。

　　1．标记　本试剂盒采用随机引物标记方法，可标记少至10ng，多至3μg的DNA。能在新合成的DNA链每20～25个核苷酸，掺入一个Dig-dUTP，反应时间约为1h。

　　2．杂交　按标准杂交方法进行。可以采用尼龙膜或硝酸纤维素膜。用过的杂交液可冻存于-20℃，重复使用。

　　3．免疫学检测　封阻后，检测反应的第一步，抗体结合物与标记DNA结合，出现杂交的半抗原-标记DNA，显色反应起始是在碱性pH条件下加入无色的显色剂X-磷酸盐和NBT，在几分钟内便开始出现蓝色，显色反应的过程持续3d。典型的例子是在24h后终止显色反应。用二甲基甲酰胺洗掉尼龙膜上的颜色后，尼龙膜可重新用于杂交。

　　4．应用　地高辛配基标记DNA探针及检测试剂盒，能检测0.1pg的同源DNA，能检测1μg哺乳动物DAN中的单拷贝基因，与放射性标记系统比较，此试剂盒能快速得到实验结果（从DNA的标记和杂交至见到检测结果24h内能完成），而且消除了放射性的不安全问题。这试剂的灵敏度与特异性使它适用于所有的杂交技术（包括DNA-印迹转移，菌落杂交，噬菌斑杂交及原位杂交）以替代同位素标记和放射自显影术。