（二）试剂盒成份

　　1．无标记对照DNA1　此管内有20μl pBR328 DNA100μg/ml,pBR328分别用BamHⅠ,BglⅠt HinfⅠ消化，它们的混合比例为2：3：3，共有16个Pbr328片段，这些片段的大小分别为：4907，2176，1766，1230，1033，653，517，453，298，234，234，220和154×2bp。

　　2．无标记对照DNA2　此管内有20μl pBR328 DNA200μg/ml，已用EcoRⅠ线性化。

　　3．DNA稀释缓冲液　有两管，每管1ml[成分为：Tris-HCl(10mmol/L),EDTA(1mmol/L),pH8.0(20℃)]内含鲑鱼精DNA（50μg/ml）。

　　4．标记对照DNA　此管内有50μl线性化pBR328DNA，按标记方法已标记有地高辛配基dUTP,含20μg模板DNA，每毫升含5μg合成的标记DNA。

　　5．六聚核苷酸混合物

　　6．标记用混合底物　此管内有50μl 10倍浓度的dNTP标记用混合底物，含dATP（1mmol/L）dCTP(1mmol/L),dGTP(1mmol/L),dTTP(0.65mmol/L)和Dig-dUTP(0.35mmol/L),pH6.5(20℃)。

　　7．DNA聚合酶Ⅰ大片段（标记级）　此管内有25μl DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow），2^U/μl。

　　8．（Dig）AP结合物　此管内有200μl多克隆羊抗地高辛配基Fab-片段，结合有碱性磷酸酶750U/ml。

　　9．NBT　有两管，每管1.25ml，是溶于70%（V/V）二甲基甲酰胺的硝基蓝四唑盐溶液（75mg/ml）。

　　10．X-磷酸盐　有两管，每管0.9ml，是溶于二甲基甲酰胺的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐的甲苯胺溶液（50mg/ml）。

　　11．封阻试剂　有两瓶，每瓶有50g粉剂。

　　（三）需配制的溶液

　　EDTA（0.2mol/L）,pH8.0 (20℃);LiCl(4mol/L);70%(V/V)乙醇；Tris-HCl(10mmol/L);ED－TA(1mmol/L),pH8.0(20℃);10%(V/V)N-十二烷基肌氨酸钠盐；10%（V/V）SDS；20×SSC：3mol/l NaCl;0.3mol/L柠檬酸三钠；pH7.0 Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L);pH7.5Tris –HCl(100mmol/L);NaCl(100mmol/L);MgCl2(50mmol/L)pH9.5(20℃)。

　　（四）操作方法

　　1．标记DNA探针　每次标准的反应可标记10ng至3μg线性的DNA，也可标记更大量的DNA，但所有的成分和体积要相应增加。

　　（1）DNA探针热变性，煮沸10min，迅速冷却于冰/乙醇中5min以上，待用。

　　（2）取Eppendorf管（1.5ml）置于冰上，加下列及试剂：

　　新鲜变性的DNA 　　　　　　　　　　1-3μg

　　六聚核苷酸混合物 　　　　　　　　2μl（管5）

　　dNTP标记用混合底物 　　　　　　　2μl（管6）

　　加无菌重蒸水至　　　　　　　　　 19μl

　　DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow）　　　1μl（管7）

　　（3）在37℃保温至少60min，可到20h。

　　（4）煮沸5min，终止反应。

　　（5）15000rpm离心30s，置于冰上待用。

　　2．预杂交　按100cm²膜用20～40ml预杂交溶液，预杂交时使溶液处于流动状态。

　　预杂交液组成：5×SSC

　　0.5%（W/V）封阻试剂（管11）

　　0.1%（W/V）N-十二烷酰肌氨酸钠

　　0.02%（W/V）SDS

　　膜放入塑料袋，灌入预杂交液，排除气体后密封，在65℃预杂交过夜。

　　3．杂交　按100cm2膜用2.5ml杂交液，杂交时偶尔摇动杂交袋，使里面的溶液重新分配。

　　杂交液组成： 50%甲酰胺（V/V）

　　5%（W/V）封阻试剂

　　5×SSC

　　0.1（W/V）N-十二烷酰肌氨酸钠

　　0．02%(W/V)SDS

　　新变性标记DNA（150ng/ml）

　　杂交液取代预杂交液，替换间膜不能干，成功地替换应是膜与塑料袋间形成一层杂交液膜。于42℃杂交过夜（16～20h）。

　　4．洗膜　　按100cm²膜用250ml洗膜液计算。

　　（1）在室温下用2×SSC/0.1%（W/V）SDS溶液漂洗，5min，2次。

　　（2）在65℃条件下用0.1×SSC/0.1%SDS溶液漂洗，10min，2次。

　　（3）在室温下用2×SSC溶液漂洗1次。

　　5．免疫测定

　　（1）配制溶液

　　缓冲液1：Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L)pH7.5(20℃）

　　缓冲液2：0.5%(W/V)封阻试剂(管11),配制于缓冲液1中(封阻试剂不会快速溶解,因此应预早1h前配制此溶液,将试剂溶于50～70℃,此溶液保持混浊)。

　　缓冲液3：Tris-HCI(100mmol/L);NaCI(100mmol/L);MgCI₂(500mmol/L)pH9.5(20℃)。

　　缓冲液4：Tris-HCl(10mmol/l);EDTA(1mmol/L);pH8.0(20℃)

　　显色溶液：新鲜配制，在10ml缓冲液3中，加45μlNBT溶液（管9）和35μlX-磷酸盐缓冲液（管10）。

　　2． 显色过程

　　A．膜在缓冲液1中短暂洗涤（1min）。

　　B．在100ml缓冲2中保温30min。

　　C．再用缓冲液1短暂洗涤。

　　D.用缓冲液1稀释的抗体结合物(管8)至150^U/L(1:5000);稀释后的抗体结合物在4℃只能稳定12h。

　　E.膜在20ml稀释的抗体结合物溶液中保温30min。

　　F.用100ml缓冲液1洗膜,以除去未结合的抗体结合物,15min,2次。

　　G.膜在缓冲液3中平衡2min。

　　H.在黑暗条件下,膜与10ml显色溶液放入塑料袋内密封或放入合适的盒子内,几分钟内开始出现颜色,一般显色反应在1天后全部完成。当颜色显影时，不可振荡或搅拌。

　　I．当要求的点或带已被检测时，可用50ml缓冲液4洗膜5min终止反应。

　　J．摄相。

　　说明：上述各反应均在室温下进行，除了显色反应外，均需振荡或搅拌。

　　（五）排除实验中问题的方法

　　1．DNA不能有效地被标记时考虑

　　（1）用酚/氯仿抽提和/或乙醇沉淀，重新纯化DNA。

　　（2）标记反应的保温时间延长（增至20h）。

　　（3）DNA变性或许不完全，这时对大片段DNA特别重要。

　　2．不能达到预期的灵敏度时考虑

　　（1）DNA标记率。

　　（2）增加标记DNA的浓度或增加杂交时间。

　　（3）显色反应的时间可延长至3d。

　　3．若显色时背景过深，可采取

　　（1）在杂交溶液中减少标记DNA量。

　　（2）增加杂交溶液的体积，使膜随意漂浮在溶液中。

　　（3）某些类型的尼龙膜可能产生深色背景，因此可采用其它类型的尼龙膜或改用硝酸纤维素膜。

　　（4）在杂交和检测过程中增加封阻试剂的浓度。

　　四、核酸的分子杂交

　　核酸分子的固相杂交是将待测核酸样品结合在某种固相支持物上，然后与溶液中的标记探针进行杂交。目前使用最多的固相支持物是硝酸纤维膜。这里重点介绍直接点样技术，转移技术及其它常用的杂交技术。

　　（一）斑点杂交的直接点样法

　　斑点杂交或叫打点杂交（dot-blot hybridization），其主要特点是事先不用限制内切酶消化或用凝胶电泳分离核酸样品，操作简便，灵敏度高。一个点样品只含0.25～1pg的DNA也能检测到。但不知道杂交片段的大小（碱基对数）。

　　1．DNA的打点法（DNa Dot Blot）

　　（1）膜的处理：戴上干净手套，取出硝酸纤维膜，按需要剪成一定大小，量好各样点间距离，用软铅笔标记。

　　（2）DNA变性：将DNA溶液于1×TE（pH8.0）缓冲液中或蒸馏水中，取一定量DNA样品加于小塑料管中，在100℃沸水中煮10min，迅速入冰水中。

　　（3）点样：用塑料或硅化玻璃或微量加样器取1～5μl变性DNA，将滴管放在硝酸纤维膜上，使DNA慢慢吸在滤膜上，点样完后凉干。

　　（4）固定：将凉干的滤膜夹在滤纸中，于80℃干烤2～3h，然后进行杂交。

　　2．RNA的打点法（RNa Dot Blot）

　　（1）膜的处理：同DNA的打点法。

　　（2）RNA变性：将提取的RNA与50μl 20×SSC/甲醛（30μl 20×SSC加20μl甲醛）混合，65℃水浴15min。

　　（3）点样：同DNA的打点法。

　　（4）固定：同DNA的打点法。

　　（二）DNA的吸印转移法（Southern Blot）

　　DNA经过限制性内切酶消化和凝胶电泳后，放入碱性溶液中使其变性，将变性后的单链DNA从凝胶中按原来位置和顺序用滤纸吸印转移到硝酸纤维膜上，然后再与标记探针杂交。此方法比较准确地保持了特异DNA序列在电泳图谱中的位置，而且能测定分子量。

　　试剂：变性液：0.5mol/L NaOH, 1.5mol/L NaCl

　　中和液：1mol/l Tris-HCl, 1.5mol/L NaCl pH8.0

　　20×SSC:0.3mol/L柠檬酸钠，3mol/l NaCl

　　1．电泳　取DNA约5μg加限制性内切酶进行酶切，电泳鉴定酶切完全后，取酶消化后的DNA点样于0.8%～1.2%的凝胶上，以0.8～1V/cm电压电泳过夜，在溴酚蓝离凝胶前缘0.5cm处停止电泳。将电泳后的凝胶翻转，紫外灯照射10～20min后拍照。

　　2．变性与中和　将电泳后的凝胶放入变性液中25℃振荡60min。蒸馏水洗胶1min，将凝胶放入中和液中25℃振荡60min。

　　3．转移　取托盘一只，放入10×SSC溶液约500～1000ml，托盘上搭一块比凝胶稍宽的长方形玻璃，取一长方形Wateman paper（滤纸）搭在桥上，两边浸入10×SSC溶液中，仔细去掉玻璃与滤纸之间的气泡（用玻棒在滤纸上滚动）。将凝胶放在滤纸上，去掉凝胶与滤纸之间的气泡。将硝酸纤维膜放入2×SSC溶液中浸湿后放在凝胶上（如NC膜浸湿不均匀，则考虑更换NC膜，操作时手切勿触及NC膜），去掉凝胶与NC膜之间的气泡。将一张滤纸（长和宽均比NC膜小1mm）放在NC膜上，仔细去掉气泡。将吸水纸切成与滤纸大小，重叠放在滤纸上，再压一重物约500～1000g。转膜24h，中间更换吸水纸。

图23-7　Southern转膜示意图

　　4．固定　　用2×SSC溶液洗膜5min去掉残余凝胶，让膜自然凉干。将凝胶放入EB液中30min，取出在UV灯下观察是否有DNA残余。80℃烤膜2h，然后将膜封入塑料袋进行杂交。

　　（三）RNA的吸印转移法（Northern blot）

　　在RNA凝胶电泳之前，先用乙二醛等变性剂处理RNA，再在适宜条件下电泳使充分变性的RNA直接吸印到硝酸纤维膜上。固定后除去变性剂，然后进行杂交。