第一节　原位杂交技术在染色体铺片的应用

　　近年，不少科技工作者将原位杂交组织细胞化学技术（ISHH）应用于细胞分裂中期（Metaphase）和分裂间期（Interphase）的染色体铺片上，利用标记的核苷酸探针与之进行杂交，可在光镜或电镜水平检测到不同的特异性的标记物。目前，原位杂交组织化学在染色体铺片的应用主要在三个方面：染色体的基因分配或基因图（Gene assignment）的研究、癌细胞或癌前组织的染色体异常的间期细胞遗传学分析研究和性染色体对胚胎的生前诊断。在依次介绍这些方法的应用以前，我们先简要介绍一个有关染色体的基本的知识和染色体铺片的制作方法。

　　一、有关染色体的基本知识及制片

　　（一）染色体的形态结构

　　体细胞的染色体是46个，23个，其中22对是常染色体，一对是性染色体。男性一对XY，女性为XX。染色体的形态随着细胞周期的不同而有所改变，在光学显微镜下所看到的染色体是细胞分裂中期染色体（metaphase chromsome）。

　　每个染色体含有两条染色单体，呈赤道状彼此分离，只有着丝粒处相连。根据着丝粒的位置分为三种类型，中部着丝粒型，亚中部着丝粒和端着丝粒型（图21-1）。

图21-1　正常人体细胞的三种染色体
1．中部着丝点染色体；2.近中部着丝点染色体；3.近端部着丝点染色体
1.非显带染色体特征　　分为七组

　　A组（1～3）：为最大的具中部着丝粒染色体，这组染色体相互间很易区别。第1号和第2号染色体大小相似，唯第2号染色体为近中部着丝粒染色法。第3号染色体较1、2号染色体小，为中部着丝粒染色体。

　　B组（4～5）：为大的具中部着丝粒染色体。2对染色体之间在形态和长度上较难区别。

　　C组（6～12号和X）：为中等大小的具中部或近中部着丝粒染色体。这组染色体较难区分，其中第6、7、11号和X染色体为中部着丝粒染色体，第8、9、10和12号染色体为近中部着丝粒染色体。女性为2个X染色体。男性只有1个X染色体。

　　D组（13～15号）：为中等大小的具近端着丝粒染色体。在其短臂上有随体。与他组染色体有明显区别。但3对染色体之间较难区别。

　　E组（16～18号）：为小的具中部或近中部着丝粒染色体。第16号染色体为中部着丝粒染色体，第17号和18号染色体为近中部着丝粒染色体。不过，着丝粒位置第18号较第17号染色体更近端部。

　　F组（19～20号）：为更小的中部着丝粒染色体。2对染色体之间，形态上很难区别。

　　G组（21～22号和Y）：为最小的近端着丝粒染色体。第21号和22号染色体大小相似，且短臂上常连有随体。Y染色体常比第21和22号染色体大、染色深。且无随体。Y染色体长臂2个染色单体比较靠拢，长臂末端也较模糊。

　　2．G带染色体的特征

　　第1号染色体：识别并不困难，但初学者易把长短臂颠倒。短臂的近侧1/2处有2个深带。远侧有一半几乎为浅染区；短臂共分3区。界标为近侧的深带（2区1带）和中段的深带（3区1带）。长臂近侧为一窄的浅带。中段和远侧段各有2条深带；长臂共分4区，界标为次缢痕远侧的浅带（2区1带）、中段的深带（3区1带）和远侧的深带（4区1带）。

　　第2号染色体：短臂可见4条深带。中段的2条深带常互相靠近，表现为1条深带；短臂共分2区，界标为1浅带（2区1带）。长臂可见4～7带，近侧着色甚浅，中段及远侧着色较深；长臂共分3区，界标为2个浅带（2区1带和3区1带）。

　　第3号染色体：短臂近侧可见2条深带；远侧可见3条深带，其中远端的1条带较窄，染色浅；短臂分为2区，界标为1浅带（2区1带），长臂近侧和远侧各有1条较宽的深带：好的标本近侧深带可分为2条深带，远侧深带可分为3～4条深带；长臂分为2区，界标为1浅带（2区1带）。长臂深带宽度略大于短臂深带。

　　第4号染色体：短臂有1～2条深带，只1区。长臂有均匀分布的4条深带；长臂分3区；界标为2浅带（2区1带和3区1带）。

　　第5号染色体：短臂有1条深带，只1区。长臂有5条深带，中段的3条深带常靠近；长臂分3区，界标有1深带（2区1带）和1浅带（3区1带）。

　　第6号染色体：短臂近侧有1宽的浅带，远侧为1深带；短臂分2区，界标为1浅带（2区1带）。

　　第7号染色体：短臂有2～3条深带，近末端带着色很深；短臂分2区，界标为1深带（2区1带）长臂有3条深带，近侧和中部的2条带较深；长臂分3区，界标为2深带（2区1带和3区1带）。

　　第8号染色体：短臂有2条深带，远侧深带较近侧深带着色深；短臂分2区，界标为1浅带（2区1带）。长臂有3～4条深带，远中的深带着色较深；长臂分2区，界标为1深带（2区1带）。

　　第9号染色体：短臂有1～2条深带；短臂分2区，界标为1深带（2区1带）。长臂2条深带。长臂分3区，界标为2深带（2区1带和3区1带）。

　　第10号染色体：短臂有2条深带，近侧较近侧深带着色浅；短臂只1区。长臂有3条深带，近侧深带着色更深；长臂分2区，界标为1深带（2区1带）。

　　第11号染色体：短臂有1～2条深带；短臂只1区。长臂有2条深带，在近侧深带与着丝粒之间有1宽的浅带；长臂为2区，界标为1浅带（2区1带）。

　　第12号染色体：短臂有1条深带；短臂只1区。长臂有3条深带，中间的1条深带宽，近侧深带与着丝粒的距离较第11号染色体近；长臂分2区，界标为1深带（2区1带）。

　　第13号染色体：长臂有4条深带，中间2条深带宽；长臂分3区，界标为中间的2条深带（2区1带及3区1带）。

　　第14号染色体：长臂有45条深带，近侧的第2条带和远侧的带着色更深；长臂分3区，界标为2条深带（2区1带和3区1带）。

　　第15号染色体：长臂有4条深带，近侧的第2条带较宽；长臂分2区，界标为1深带（2区1带）。

　　第16号染色体：短臂有1～2条深带，短臂只1区。长臂有2条深带，近中部深带明显；长臂分2区，界标为1深带（2区1带）。

　　第17号染色体：短臂有1深带；只1区。长臂1～2深带，远侧深带较宽，在深带与着丝粒之间有1宽的浅带；分2区，界标为浅带（2区1带）。

　　第18号染色体：短臂为1浅带区。长臂有2条深带；为2区，界标是1浅带（2区1带）。

　　第19号染色体：着色最浅。着丝粒周围为深带。短臂和长臂均为1区。

　　第20号染色体：短臂有1深带，较宽；短臂和长臂均为1区。长臂有1深带，较宽。

　　第21号染色体：最小的1个染色体。长臂紧按着丝粒处有1深带，较宽；长臂为2区，界标为1深带（2区1带）。

　　第22号染色体：较21号色体长，长臂紧接着丝粒处有1深带，较窄。短臂和长臂均为1区。

　　X染色体：短臂中部有1条深带；分2区，界标是深带（2区1带）。长臂有4条深带，其中近槽深带最宽；分2区，界标是近侧深带（2区1带）。

　　Y染色体：长臂远侧半色着深，为1深带；短臂和长臂均为1区。

　　现在国内流行一种辨认G带每个染色体的口诀，稍加修改如下：

一秃二蛇三蝶飘，四象鞭炮五黑腰；

六号短空小白脸，七上八下九苗条；

十号长臂近带好，十一低来十二高；

十三十四十五号，三个长臂一二一；

十六长臂缢痕大，十七长臂带脚镣；

十八人小肚皮大，十九中间一黑腰；

二十头重脚脚底轻，二十一带宽身体小；

二十二带小身体大，Y长一宽近末端；

X短臂一、长臂三，中间象个工字般。

　　（二）染色体G显带技术

　　1．原理　　染色体的化学成份是核酸和蛋白质两部分。核酸以DNA为主，蛋白质有组蛋白和非组蛋白两种。因此染色体经蛋白水解酶类物质处理后，蛋白质已被水解而使DNA分子中碱基暴露，由于碱基中G/C和A/T组合的比例不同，对染料结合的程度不一，如这一段A/T碱基的成份多，则Giemsa染料易与它结合成深染；另一段G/C碱基的成份多，则Giemsa染料不易与其结合，结果成淡染，由于整条染色体上A/T和G/C的分布不匀，这样在染色体上呈现出深浅不一的条纹或者称带纹，该技术用Giemsa染色，故其带型称为G带。

　　2．操作过程

　　（1）按常规染色体技术制片。

　　（2）制好的染色体玻片，在80℃烘箱中，烘烤2h，置于室温。

　　（3）4℃冰箱PBS液5min。

　　（4）4℃冰箱PBS缓冲液含胰蛋白酶终浓度0.025%，消化10min。

　　（5）蒸馏水洗净胰酶。

　　（6）Giemsa染色20min。

　　（7）蒸馏水洗净染色液，晾干镜检。

　　4℃低温胰酶处理片子，其优点是：时间较长，易掌握。配制1次试剂可用1～2个月。

　　（三）高分辨染色体G带技术

　　1．原理常规的G带显带技术，在人类染色体中仅观察到320～450条带纹，对于一些染色体细微结构异常的识别是不够的。

　　氨甲碟呤抑制二氢叶酸还原酶，阻止叶酸转变为四氢叶酸，从而干扰了脱氧胸腺嘧啶核苷酸的合成，阻止了DNA的复制，使细胞被阻止在S期内。胸腺嘧啶核苷解除氨甲喋呤的作用，让被阻滞的细胞同时开始进行DNA复制，进而同步分裂；放线菌素D可增加染色体的长度，能显示更多的亚带。放线菌素D与核酸相互作用：①插入脱氧鸟嘌呤核苷酸和脱氧胞啶核苷酸之间，使DNA变长；②能与染色体缩短有关的特殊蛋白和DNA结合，因此，抑制了染色体正常的收缩过程。秋水仙胺抑制纺垂丝的形成，可以得到较多的晚前期、前中期、早中期的分裂相。这样染色体带纹可增加到500和850条，甚至可达1200～2000条之多。这一步对于研究较细小的染色体缺陷的基因定位，具有很大的意义。

　　2．材料和方法

　　（1）4ml培养液（为从日本进口的RPMi 1640或从美国进口的F10液）虽自制的小牛血清1ml。每ml加青、链霉素各100单位，pH=7.2。

　　（2）每瓶培养液内，另加自制的PHA或重庆产的PHA2.5mg。

　　（3）取外周血2ml，分别装入含培养液的4个培养瓶内。

　　（4）37℃孵育箱内培养72h。

　　（5）加入氨甲喋呤，最终浓度10^-7mol/L，继续培养17h。

　　（6）用不含血清的培养液冲洗两次后，将上清液吸出，再加入含胸腺嘧啶核苷（最终浓度为10^-5mol/L）的培养液，继续培养3h。

　　（7）再加入放线菌素D，最终浓度为3μg/ml，培养2h。

　　（8）加秋水仙胺，最终浓度为0.03μg/ml，培养2h。

　　（9）按常规染色体技术制片。

　　（10）按一般常用的G带显带技术，显示带纹。

　　3．注意事项

　　（1）高分辨染色体，重叠多，应增加固定次数和固定时间，可置于4℃冰箱存放24h后制片，用高距离滴片，以使染色体分散开。