（2）细胞培养液同步化后，如果用5-溴-2脱氧尿核苷（5-bromodeoxyuridine,BrdU），则需加黑物包装进行暗培养。

　　（四）外周血培养及染色体制片技术

　　1．国内应用的外周血培养染色体技术

　　（1）原理：外周血染色体制备是目前应用最广泛的细胞遗传学诊断技术，亦是基本的实验技术，由于取材容易，培养过程比较简单，短期内可以得到结果，所以其实用价值很高。

　　血液中含有红、白两类细胞，它们均是处于未分裂的间期细胞。红细胞没有核，无分裂能力；白细胞类虽有细胞核存在，但是外周血中处于休止期。植物血球凝集素（简称PHA）能促使淋巴细胞和单核细胞转化为具有分裂作用的母细胞。染色体只有在细胞分裂中期时最典型。秋水仙素类药的药物能抑制纺锤丝的形成，使细胞分裂停止于中期，低渗处理使细胞膨胀，细胞膜破裂，染色体分散，这样就可便于分析。

　　简意流程图：

　　（2）操作过程

　　①采血：无菌干针筒从静脉取血1～2ml，用肝素抗凝（约每毫升全血内含肝素100单位）。

　　②培养液配制：RPMI 1640 　　　　　　4ml

　　小牛血清　　　　　　　1ml

　　1%PHA（自制）0.2ml

　　调节　pH为7.4后置于-20℃冰箱

　　③标本接种：每5ml培养液加入抗凝全血0.5ml。

　　④培养细胞：将接种好的培养瓶置于37℃恒温箱中培养72h。

　　⑤阻止分裂：培养至68h，加秋水仙素，最终浓度0.02μl/ml，摇匀后置于37℃恒温箱中继续培养4h。

　　⑥收获：培养物混合后，置于10ml离心管内，离心10min（1000转/min），去上清液。留下培养物。

　　⑦低渗处理：低渗液可用0.56%的KCl（或0.075mol/l KCl）5～7ml，用吸管打散沉淀物，置于37℃水浴箱中保温20min，然后加入固定液（3份甲醇：1份冰乙酸）1ml用吸管打匀，预固定1～2min。

　　⑧离心：1000转/min离心10min。

　　⑨固定：吸去上清液，留下沉淀加上述固定液6～8ml，用吸管将沉淀物打散，固定30min后离心，1000转/min离心10min，取出吸去上清液留下沉淀。

　　⑩重复上述固定离心1次。

　　⑾标本制作：最后1次固定、离心后吸去上清液，留下沉淀再加少量新鲜固定液约0.3ml打散细胞悬浮液即可进行制片。制片之前先将载玻片经清洁液洗净处理后，置于冰箱内制成冰片。取冰片1张滴上2～3滴细胞悬液。利用冰片的表面张力关系使液体迅速向玻片四周散开，与此同时用嘴轻轻吹向滴片处，以助其更快散开，然后在酒精灯火上通过7～8次后，自然干燥或烤干均可。

　　⑿染色：Giemsa染液1份和pH7.4磷酸缓冲液9份，混合后，染色20min，蒸馏水洗去余下染液，晾干，镜检观察。

　　（3）注意事项

　　①无菌操作是关键。培养液不得污染。

　　②所用药品不得失效，特别是PHA，既要使淋巴细胞转化，又不能过量。

　　③小牛血清优质、无菌。

　　④秋水仙清素低浓度4～6h效果最佳，过量则染色体易收缩。

　　⑤固定液和Giemsa染液要求新鲜配用。

　　⑥培养时间72h较好。

　　（4）各种物品清洗与消毒

　　①玻璃器皿用后，立即用自来水冲洗，再用洗衣粉刷洗，然后用自来水冲洗。待干，泡入清洁液24～48h，取出，自来水冲洗，再用双蒸水冲洗，干后备用。

　　②接触洗液时，带上橡皮手套，围裙等防护品。

　　常用清洁液配制：

　　重铬酸钾25g

　　水200ml

　　浓硫酸1000ml

　　③先将重铬酸钾在水中溶解，然后慢慢加入浓硫酸，边加边搅拌，防止过度发热。使用3～6月后检查，若变绿表示失效。

　　④G₅、G₆漏斗的处理：水洗净、晾干，于浓硫酸泡（或洗液中泡）24h，再用蒸馏水冲洗至加入1%BaCl₂滴无白色沉淀为止。包装消毒，15磅20min。

　　（5）橡皮塞的处理

　　新的橡皮塞洗后，先用0.5N NaOH煮沸15min，再用0.5n HCl煮沸15min，流水冲洗10min，用双蒸水泡24h，双蒸水冲洗，晾干，15磅20min高压灭菌。

　　（6）金属器械清洗

　　先用纱布或纸擦去防锈油，然后用洗涤液清洗，再用清水或蒸馏水洗净，擦干或烘干备用。

　　2．外周血细胞培养法（Bhatt B and McGee JOD,1990）

　　（1）收集静脉血（无菌），加肝素抗凝（20单位/ml）；

　　（2）加0.8ml全血入每个培养瓶（含10ml培养液），37℃培养72h；

　　培养液配制：RPMI 76ml(Gibco,Cat.No.041-1875M)

　　小牛血清　　　20ml

　　PHA　　　　　 2.0ml

　　（3）加100μl Brdu于培养瓶中，37℃再孵育16～17h；

　　（4）离心（1200rpm）8min，弃去上清液，沉淀中加入10ml RPMI 1640培养液，混匀；

　　（5）重复步骤（4）；

　　（6）沉淀中加入10ml新配制的完全培养液（含2.5μg/ml胸腺嘧啶），重新置于37℃孵育6～7h；

　　（7）在收获培养细胞前15～30min，可加Colcemid,但当同时应用BrdU时这就并非十分必要。因为BrdU是胸腺嘧啶核苷的类似物，能使染色体在富含异染色质处断裂分解，从而使显带明显；

　　（8）1200rpm离心培养细胞，弃去上清液，加入1ml 0.56% KCl（事先预热至37℃），继续加入0.56%KCl使总容量达到10ml，在37℃孵育10min；

　　（9）如上述离心，弃去上清液，在沉淀的细胞内加入新鲜的冷固定剂，（甲醇：冰醋酸=3：1，新鲜配制，保存在冰上），置冰上至少20min；

　　（10）重复步骤（9）3～4次，直至细胞悬液清洁无色；

　　（11）可较长期保存在冰的固定剂内（-20℃）或再离心后加入0.5～1.0ml新鲜固定剂，置于冰上；

　　（12）玻璃载片放在Decon（清洁液）或其它的清洁液内过夜，次日用自来水冲洗，继之蒸馏水漂洗，在60～75℃干燥，然后把载片孵育在2%丙酮液内，室温，60min。自来水冲洗，再在60～75℃干燥；

　　（13）每张载片上加10μl的细胞混悬液，空气干燥，在24h后可应用于杂交实验，也可保存在-4℃达8周之久（试剂配制法见附录四）。

　　二、应用ISHH技术对染色体制片、基因分配（Chromosomal assignment of genes）的研究

　　（一）基本原理

　　染色体上基因位置分配的研究，又叫染色体图的研究，包括基因名称、基因在染色体的位置及与相邻基因的距离及其核酸序列的研究。研究基因图的方法包括家系的连锁分析法、体细胞杂交法、重组DNA技术和原位杂交法。果蝇的线形基因图和大肠杆菌、T₄噬菌体两者的环状基因图都已绘成，目前正致力于人类基因图的绘制。人类基因约有5万～10万个，根据第八次国际人类基因定位工作会议，已定位的人类基因总数达1479个。

　　ISHH技术对染色体基因图的研究，是用同位素或生物素、地高辛标记的核酸探针，直接同中期的染色体铺片行杂交。早期的研究是用于重复序列DNA的定位，如编码核糖体的基因18S和28S核糖体RNA定位于第13～15号染色体和第21～22号染色体短臂次缢痕区。5S核糖体RNA定位于第1号染色体上长臂的远侧Iq42～Iq43。近年已能进行单拷贝基因的定位，如胰岛素基因定位于IIp 15上、C-mos原癌基因定位于Sq22上、N-ras原癌基因定位于IPI34。在染色体11的短臂上，利用ISHH技术证明4个基因依次排列，从短臂的远端依次为胰岛素、β-球蛋白、HRASI和PTH。

　　（二）操作步骤（Bhatt and MCGee, 1990）

　　在前面已介绍了制备血培养染色体铺片的方法。下面介绍的是在染色体制片上用免疫金银染色法进行原位杂交的基因定位显示、结合Giemsa染色显带技术的操作步骤。

　　1．移除内源性RNA

　　（1）加100μl RNA酶溶液，覆以盖玻片，放在有少许2×SSC溶液的湿盒内孵育，37℃，60min。

　　（2）在2×SSC溶液内移除盖玻片，以2×SSC洗2×3min。

　　（3）等级酒精系列脱水，10%，50%，70%，90%和100%，各1min，各1min。空气干燥。

　　2．探针标记和纯化用缺口平移法将生物素11-dUTP标记在DNA核酸探针上。

　　3．变性与杂交

　　加20～100ng生物素标记探针到杂交液中，加入5μl 20mg/ml人或鲱鱼精子DNA，总容量为30～40μl，离心5s，混匀后，滴于染色体铺片，覆以盖玻片，盖片四周以橡皮泥封固。放入盛2×SSC溶液温盒内75℃7～8min，使之变性，继之于37℃孵育16h。

　　4．杂交后漂洗2×SSC溶液内移除盖玻片，将载片浸入含50%甲酰胺的2×SSC溶液内，pH7.2,20min,42℃。然后作下列程序漂洗

　　　　　溶液　　　　　漂洗时间　　　　　　温度

　　　　　2×SSc 　　　　20min 　　　　　　42℃

　　　　　1×SSC　　　　 20min　　　　　　 室温

　　　　　0.1×SSc 　　　20min　　　　　　 室温

　　5．免疫细胞化学显示

　　（1）孵育载片于PBt 15min，将片缘及背面擦干，加100μl一抗于载片（兔抗生物素抗血清1：100，以PBT稀释），孵育于37℃40～60min。

　　（2）快速用PBT冲洗，擦干片缘及背面，加100μl二抗抗血清（羊抗兔IgG结合10～20nm金粒，以PBT1：50稀释）于载片染色体铺片部位，37℃孵育45～60min。

　　（3）PBS洗3×5min。

　　（4）蒸馏水洗3×5min。

　　（5）加数滴银溶液于载片上，在光镜下监测，大约需5～18min可见在染色体上出现银斑点。

　　（6）蒸馏水洗。PBT配制见附录3。

　　6．显带复制（Replication banding）

　　（1）应用5μg/ml Hoechst 33258在2×SSC溶液内，暗室中染载片20min。

　　（2）蒸馏水洗，以2×SSC封固，覆以盖玻片，盖片四周封以橡皮泥。

　　（3）紫外光照射1～16h。

　　（4）蒸馏水洗和以10%Giemsa（磷酸缓冲液稀释，pH6.8～7.2）染色10min。

　　（5）蒸馏水冲洗，空气干燥，以DPX封固。

　　（6）光镜下观察，可见棕色的银斑点在染色体上的定位，并显示其与染色体分带的关系。

　　三、利用ISHH技术对肿瘤或癌前组织的细胞间期染色体铺片进行研究

　　（一）基本原理

　　在恶性的或癌前病变的组织，染色体组含量与结构的畸变在部分病例中与疾病的预后相一致。由于染色体基因的变化可能导致肿瘤的发生与进展，利用一些技术预测这些遗传物质的变化可为恶性肿瘤的检测及了解其进展和预后提供资料。流式细胞计（FCM）和染色体组型，即核型分析（karyothping analyses）等技术曾被用于这个领域的研究。FCM可测定肿瘤细胞DNA的含量，但它不能显示特异性染色体的结构异常，而且对微量的DNA含量改变难以检测。核型分析可以显示染色体结构和含量的变化，但要分析肿瘤细胞的核型只有在细胞培养以后。细胞培养时细胞的高度分裂指数和细胞的生长会导致染色体物质的丢失，而且核型分析不能显示特异性DNA探针的原位杂交技术，能够检测在细胞分裂间期细胞核内染色体数量和结构的异常变化。因此，这项技术又被称为“间期细胞遗传学分析法（Interphase Cytogenetics Analysis, ICA）。间期细胞遗传学的基本原理是利用合成的特异性DNA探针，标记以同位素、生物素、地高辛或荧光素，对外周血、肿瘤细胞或癌前组织的离散培养细胞的染色体铺片或切片进行DNA-DNA原位杂交，其杂交定位以荧光法、放射自显影或免疫组化法显示。目前ICA已广泛应用于生前诊断、肿瘤组织活检材料的诊断和基因异常的诊断。在肿瘤细胞方面，在乳腺癌，神经系统肿瘤、睾丸肿瘤，妇科肿瘤和膀胱肿瘤等均有实验报告。现已能提供的DNA探针有染色体1，7，8，9，10，15，16，17，18和性染色体X、Y，以及识别一些染色体特征性部位如着丝点（centromeric region）、染色体端极区（telomere region）的特异性重复靶核苷序列和随体的DNA探针，多数为合成的寡核苷酸探针，在应用上采取ISHH和FCM以及免疫组化相结合（有时还结合核型分析）的综合研究法（图21-2），也可用多种标记物显示不同颜色或不同标记在一张切片上同时显示多个染色体的结构或DNA含量异常，如异硫氰酸荧光素（FITC）和罗丹明200结合，前者显示黄绿色，后者显示红色，ABC-DAB显示法与地高辛-碱性磷酸酶系统相结合，前者反应物为棕色，后者为紫蓝色。这种联合应用法又叫多靶点原位杂交法（multiple-target ISH）。