图21-2 肿瘤组织处理流程图

　　（二）本操作方法

　　1．玻片与组织前处理

　　（1）肿瘤细胞混悬液的制备：新鲜的从活检或外科手术或尸检获得的材料建议按图21-2的流程处理进行综合研究。用以制作细胞混悬液的组织在处理前可保存于液氮内。组织块在玻皿中切碎或用细胞打碎机打碎，用100μm孔直径的尼龙网过滤器滤过，固定在70%乙醇，-20℃，如保存于-39℃可保存数月至数年。

　　（2）分离的细胞由于表面有细胞质的覆盖，在荧光显微镜下会显示强烈的自动荧光，从而掩盖了ISHH的信号。可采取下列两种方法移除覆盖的细胞质；

　　①乙醇固定后的细胞，应用以前在新鲜制备的甲醇/醋酸（3：1）固定液内0℃，5min。滴2～3滴固定后的细胞混悬液于涂有粘附剂的载片上，空气干燥，然后快速浸入70%醋酸内10～60s。应用蒸馏水洗，在100%乙醇内脱水，空气干燥。

　　②应用胃蛋白酶蛋白水解作用。加5μl细胞混悬液于载片上，空气干燥30min或在80℃烤箱中干燥。胃蛋白酶（2500～3500单位/mg蛋白质，Sigma,USA）应用0.01mol/L HCl稀释至50～400μg/ml，10min 37℃；再用0.03% H₂O₂和PBS漂洗，以4%多聚甲醛固定，0℃，5min；载片脱水，空气干燥，在80℃加热变性30min。这个方法较①更好，能移除蛋白质、暴露核DNA和有助于探针的穿透，最重要的能较好的保持形态学的结构，以利于ISHH的荧光信号的显示。应用①法，细胞经常呈扁盘状，而且细胞质的自动荧光未完全消失，影响ISHH荧光信号的显示，但实验表明，必须严格掌握胃蛋白酶的浓度，过低，由于细胞质的覆盖，基因拷贝数会减低，而过高浓度的胃蛋白酶会导致过度消化影响细胞的形态结构。

　　（3）组织切片处理

　　①冷冻切片：切片厚5μm，放置有粘附剂的载片上，空气干燥，固定在4%多聚甲醛-PBS溶液，0℃，15min。固定后以PBS和0.01n HCl漂洗，以胃蛋白酶（20～100μg/ml，用0.01N HCl配制），37℃，30min，PBS漂洗2×5min，在4%多聚甲醛内固定15min（0℃），PBS洗2×5min，系列等级乙醇脱水，空气干燥。杂交前，在80℃加热30min使之变性。

　　②石蜡切片：切片厚5μm，漂洗在40℃温水中，捞片于有粘附剂的载片上，空气干燥，56℃加热1～16h，二甲苯脱蜡2×3min甲醇冲洗2×5min。应用1%H₂O₂（用甲醇配）溶液封闭内源性过氧化物酶活性。以甲醇冲洗，空气干燥，以胃蛋白酶（4mg/ml,用0.2n HCl配）37℃ 30min。消化后，载片以PBS冲洗。在杂交前，载片孵育于1%甘氨酸溶液-PBS中15min，以PBS冲洗和系列酒精脱水，空气干燥。载片在80℃孵育30min使之变性。

　　2．杂交　　本实验的杂交液略区别于其它实验，否则染色体1号和18号的DNA探针不仅结合1号和18号染色体，还会同时结合染色体9，6，13，21。杂交液配方：

　　甲酰胺　　　　　　 60%（V/V，2×SSC配，pH5.0）

　　鲱鱼精子DNA 　　　　1μg/μl

　　余与一般杂交液配制相同

　　对多靶点ISHH，须另加入1mmol/L KCN入杂交液，每张载片加5μl的含特异性DNA探针（2.5ng/μl）的杂交液，以盖片覆盖，四周用橡皮泥封固，先在80℃热板上5～10min使DNA变性，细胞混悬液制片变性时间只需2.5min，然后在37℃杂交，孵育过夜。

　　3．杂交后漂洗同本节　（二）杂交后漂洗步骤。

　　4．显示步骤根据标记物的种类（同位素、荧光素、生物素或地高辛）分别进行显示（与第二十章　中叙述相同）。

　　5．结果在光镜下可见染色体结构的改变，如在膀胱肿瘤细胞，其DNA含量经FCM显示高于正常组织1倍，在双靶ISHH显示载片上，可见肿瘤细胞间期核内，1号染色体为3倍体，而18号染色体为2倍体。在肿瘤细胞内应用双重靶点或多重靶点ISHH技术可见细胞间期核内多个染色体的众多畸变相。

　　ISHH技术作为一项快速与敏感的侦检细胞间期细胞核内染色体畸变的新技术，可结合病理材料的常规组织切片、免疫组化染色和FCM等对病检材料做出早期的、准确的诊断，并对肿瘤的预后与进展等有所了解。本技术成功的关键在于具有特异性的DNA探针和ISHH的侦检程序，比如染色体的拷贝数与肿瘤细胞前处理的方法有关，如移除蛋白质不彻底，就会使侦检到的染色体拷贝数减少。又如在切片上进行细胞间期染色体的ISHH时，常见到一些细胞核碎片呈不同形状的斑点状（在涂片上不会出现此种图像）。对ISHH所获得资料的分析，须经过反复的实践，比如模糊的或分裂的斑点可以是非整倍体（aneuoploidy）的假阳性反应，产生于细胞周期的G₂期。

　　四、利用性染色体特异性DNA探针的ISHH技术

　　（一）基本原理

　　利用性染色体X或Y的特异性DNA探针的ISHH技术进行胎儿生前（Prenatal）性别的诊断，样品取自于羊水、绒毛或胎儿的血液。近年，科技工作者又成功地进行了胚前（pre-embry－o）或植入前（preimplantation）的ISHH诊断。所谓胚前诊断是在受精卵植入子宫内膜前的4～6细胞期，以显微操纵器（micromanipulator）或微型吸管穿破透明带，将分裂球或其中的部分细胞吸出放入培养液内，应用ISHH技术进行性染色体的分析，如有染色体畸形，可及早移除，避免以后进行人工流产术。本技术可还用于鉴别精子是带X或Y染色体。如果1个妇女遗传性基因是与X染色体相联系的，那么可给予人工授精只带X染色体的精子以避免其子代有遗传疾病的危险。当然带X染色体的精子的分离技术还有待于研究和建立。目前这还是一种实验性设想。羊水可在16～20周妊娠期吸取。在18～19周时，20ml的羊水内大约含100万个细胞，含大约7μgDNA。绒毛膜的绒毛可在3～6月取，每次可获5～50mg的组织。应注意在应用前清除母体细胞。胎血0.2～0.7ml可在17～40周采取，在15～21周，胎血中含2×10⁹白细胞/L和类似数量的有核红细胞（Miller et al, 1985）。在32～34周，有核红细胞的比例数降至0～50/每100个白细胞。这种以性染色体为探针的ISHH技术，可应用于分裂中期的染色体铺片上，也可以应用于间期细胞核制片。性染色体ISHH技术在下列场合特别有用，如（1）当无足够的分裂细胞供可靠的细胞遗传学分析时；（2）当胎儿面临性染色体连锁遗传性疾病的危险而需做迅速的性别确定时；（3）协助鉴别45，X/46，XY镶嵌和其它异常染色体的镶嵌类型；（4）当一雌性具有一Y染色体的杂交时，应检查其父母的血样品，因为在正常情况下有部分的雄性具有2个Y染色体。这里只叙述了性染色体在ISHH技术的应用，如用同样技术标记其它染色体也可能对其它遗传性疾病进行诊断，如Julien等（1986）曾应用染色体21号DNA探针于间期细胞核，出现3倍体，为常见遗传性疾病Down氏综合征的诊断特征（发病率为1/700出生者），同样，在Edward氏综合症（遗传性疾病出现率1/3000出生者）显示18号染色体为3倍体。West实验室进行了大量的性染色体的ISHH实验，并比较了各种标记物的优缺点，他经反复实验后承认非放射性同位素标记物如生物素、地高辛具有许多优点，但在性染色体的ISHH显示，他认为至少在他的实验室同位素³H的标记优于其它的标记物。

　　（二）基本操作方法

　　1．Y染色体³H标记DNA探针原位杂交技术

　　（1）探针标记，以³H标记Y染色体DNA探针（详见第19章　）。

　　（2）原位杂交

　　①RNA酶的前处理：取1ml RNA酶保存液（10mg/ml）于250ml 2×SSC内，预热于37℃水浴中。选具有适量的细胞分布的载片孵育于稀释的RNA酶溶液中，37℃，1h。系列等级乙醇脱水，70%，90%，100%乙醇各2min，空气干燥。

　　②相当250ml的预杂交液（含70%甲酰胺，0.6×SSC配），70℃水浴。置载片于此预杂交液内2min以使靶DNA变性，如（1）经系列等级乙醇脱水，空气干燥。

　　③DNA探针准备与变性

　　杂交液：10×SSC　　　　20%

　　tRNA 　　　　　　　　　10%

　　甲酰胺 　　　　　　　　50%

　　硫酸葡聚糖 　　　　　　20%

　　DNA探针-³H　　　　　　 20%

　　均匀混合，70℃水浴5min使探针变性，然后迅速置冰上冷却。

　　10×SSC：1.2mmol/L NaCl

　　0.15mmol/L醋酸钠

　　0．2_{mol/L NaPO4}

　　tRNA(Sigma R1759)4mg/ml(用TE缓冲液配)，-4℃保存。

　　TE缓冲液：10mmol/L Tris,1mmol/L EDTA,Ph7.5。

　　每张载片加20μl含探针的杂交液，覆以盖玻片，四周用橡皮泥封固，于37℃孵育过夜。可测定³H的放射比性，以了解每张载片的探针含量。

　　④杂交后漂洗，次日移除盖玻片，用缓冲液39℃漂洗

　　50%甲酰胺1×SSC 　　　　4×5min

　　1×SSC　　　 39℃　　　 4×5min

　　⑤系列等级乙醇脱水，70%，90%，100%各2min，空气干燥。

　　（3）放射自显影（详见二十章　第一节　）：浸入核乳胶，暗盒于冷室或4℃冰箱储存，显影，定影，复染，封固和观察。应用³H标记pHY2.1DNA探针，其曝光时间大约为6～7日。

　　2．杂交前精子的处理

　　（1）取1ml用缓冲液清洗过的精子，加1ml 6mmol/L EDIT(60μl 0.2mol/L EDTA加1940μl的BWW培养基)。留置于室温5～10min，离心（1000rpm(175×g)5min。

　　（2）弃上清液，沉淀的精子内加1ml 2mmol/L DTT(dithiothretiol, DTT,二硫苏糖醇)，配法：154μl的DTT加1846μl(4g/ml)BWW培养基（Gibbers et al, 1971），置室温45min,再离心1000rpm 5min。

　　（3）弃上清液，用BWW培养基再稀释、离心。

　　（4）加新鲜配制固定剂（甲醇：醋本以=3：1），反复混匀或置于漩涡式的混匀器上混匀，室温30～60min，离心。

　　（5）加数滴新鲜固定剂于离心管中，如上再混匀。迅速从混匀液中取2～3滴精液滴于载玻片上，空气干燥，以相差显微镜检查确有精子存在，保存在清洁的干盒中备用。

　　（6）在ISHH以前，取出载片，加数滴0.05% SDS(20μl 0.05% SDS/每2ml BWW培养基)，静置5min，倾去SDS（十二烷基磺酸钠，配制法见附录2），以2×SSC漂洗，系列等级乙醇脱水，70%，90%，100%各2min，空气干燥。

　　（7）杂交步骤同上，杂交后以0.5%伊红黄（Eosin yellow）复染，自来水冲洗，空气干燥，DPX封固。

　　本节　简要介绍了ISHH技术在染色体铺片应用的三个方面，并摘要介绍了它们的应用及操作方法。由于这一技术在国际上也处于刚起步阶段，其发展主要在近10年，国内尚未开展，因此，此一技术的应用还有待于不断的摸索与完善。必须说明的是ISHH在染色体制片的应用也需设置对照实验组（详见第二十章　第一节）。