主要农作物转基因研究现状和展望

　　DNA  双螺旋结构的发现为分子生物学研究奠定了基础，DNA  重组技术的创立使分子生物学研究由理论进入实践，植物基因工程研究应运而生。在此基础上，Zambryski  等利用农杆菌介导法获得了世界上第一例转基因烟草植株，Horch  等建立了农杆菌介导的叶盘转化法，马铃薯、番茄、拟南芥等双子叶模式植物转基因先后获得成功。此后，植物转基因技术迅速发展，先后建立了除农杆菌介导法以外的  PEG  介导法、电激穿孔法、病毒介导法、基因枪法、显微注射法、花粉管通道法、超声波法等，转基因成功的物种不断扩大，涉及35个科的50多个物种，共120多种植物。经过多年的实践和优胜劣汰，多数转化方法已被逐步放弃，形成了以农杆菌介导法和基因枪法占主导地位的两大植物转基因体系。迄今为止，媒介农杆菌法获得的转基因植物占转基因植物总数85％左右。同时，将一些有利用价值的外源基因导入了植物，并逐步将转基因植物应用到农业生产。植物基因工程研究已涉及到品种改良的各个方面，包括抗虫、抗病(病毒、细菌和真菌病害)、抗除草剂、抗逆(寒冷、盐碱、重金属等)、品质改良(碳水化合物、油脂和蛋白质等)、发育调控、营养吸收等。在开展主要农作物转基因技术体系和功能基因转化研究的同时，转基因大豆、玉米、棉花、油菜等作物新品种在生产上的产业化面积逐年增加。

1  主要农作物转基因研究进展

1.1  大豆遗传转化技术与转基因研究现状

　　大豆是遗传工程最困难的作物之一，首先是因为大豆组织培养还不够成熟，虽然有很多报道认为可以从大豆下胚轴、子叶节、子叶、叶片、幼荚子叶、未成熟胚、花药等外植体获得再生植株，但频率较低，重复性较差。其次是因为大豆对农杆菌十分敏感，一经感染，难以从特殊组织或细胞再生植株。由于大豆的重要性，研究者们一直试图创立有效的组织培养和植株再生体系。无论如何，大豆遗传转化还是取得了很大成功。最早有关大豆遗传转化的研究大多利用原生质体为外植体。1988年  Hinchee  等首次利用农杆菌介导法获得了大豆转基因植株，将  nptⅡ  基因和草甘瞵抗性基因导入了大豆；McCabe  等利用基因枪法获得了转  nptⅡ  基因的大豆植株。1989年  Parrott  等利用基因枪法获得了转玉米  15kDa  醇溶蛋基因和  nptⅡ  基因的大豆转基因植株；刘博林等采用合子期子房微注射的方法，将龙葵的抗阿特拉津基因  psbA  导入了大豆叶绿体基因组，获得了转基因大豆。Sato  等利用基因枪法通过细胞悬浮系经胚胎发生途径获得转化的大豆再生植株；Christou  等利用电击转化法获得了多个外源基因稳定表达的转化细胞系。Finer  等利用基因枪轰击大豆胚状体悬浮培养物，以潮霉素为选择剂，获得了大量再生植株。黄健秋等利用改良  PEG  介导法对大豆原生质体进行  GUS  基因转化，检测到了  GUS  基因的稳定表达。Stewart  等获得了转  CryIA  基因的可育大豆植株；美国  Monsanto  公司利用基因枪轰击方法将编码5-烯醇-丙酮酸莽草酸-磷酸合成酶  (EPSPS)  基因转入大豆植株，获得了抗除草剂转基因大豆，利用农杆菌介导法将抗除草剂的  Roundup  基因转入大豆，培育了  Roundup  Ready  转基因大豆，得到了大面积产业化；Wei  等利用  PEG  法将外源基因导入大豆原生质体，得到了转基因植株。徐香玲等利用农杆菌介导法将大豆花叶病毒外壳蛋白基因转入了大豆植株；南相日等获得了转  Bt  基因的大豆植株。Zhang  等实验发现，在子叶节转化体系中，利用  bar  基因和相应的筛选剂  glufosinate，选择效果明显优于其它标记基因。Xing  等通过构建二段  T-DNA  的双元表达载体，获得了无筛选标记的转基因大豆植株。Sato  等利用农杆菌介导法将从琉篱苣中克隆的  Δ-脂肪酸去饱和脱氢酶基因转入了大豆植株，获得了无筛选标记的转基因品系，其籽粒中  γ-亚麻酸含量显著提高。此外，人们还在尝试将葡聚糖酶基因、核糖体失活蛋白基因和几丁质酶基因转入大豆，提高大豆对真菌性病害的抗性，将维生素A  合成相关基因转入大豆，改良大豆营养品质，将核酮糖1,5二磷酸羧化酶基因转入大豆，改良大豆光合效率，提高大豆产量。

　　自从获得第一例转基因大豆以来，已经有很多成功的报道，包括产业化的抗除草剂转基因大豆。目前应用最普遍的方法仍然是农杆菌介导的子叶节再生系统，其次是基因枪介导的胚性悬浮培养再生系统。其他转化方法有待于继续改进，包括花粉管  DNA  摄取法，农杆菌小花渗入法，以及农杆菌和基因枪介导的其它大豆外植体转化系统。用于大豆转化最有效的农杆菌菌系为  EHA101，外植体为子叶节，再生途径为诱导丛生芽的器官发生途径，选择标记采用  bar  基因，选择剂为  glufosinate。获得抗性大豆再生植株后，除了常用的组织化学染色和分子生物学手段外，还可以利用叶片擦抹除草剂对转基因大豆进行快速检测。

1.2  玉米遗传转化技术与转基因研究现状

　　Fromm  等最先开展了玉米遗传转化工作，利用电击法诱导玉米原生质体吸收携带氯霉素乙酰转移酶基因的质粒  DNA，电击处理后检测到了该基因在玉米细胞中的表达，进一步将  nptⅡ  基因转入玉米原生质体，获得了稳定转化的抗性愈伤组织。Rhodes  等利用电击法将  nptⅡ  酶基因转入玉米原生质体，首次获得了玉米转基因植株，但转基因植株全部不育。Grimsly  等将玉米条纹病毒基因构建到农杆菌  Ti  质粒上，利用农杆菌侵染玉米植株，导致了系统感染症状，首次证明了农杆菌可以侵染玉米细胞。Fromm  等、Gordon-Kamm  等利用基因枪介导法分别将  bar  基因、GUS  基因和萤火虫荧光素酶基因等转入玉米，获得了转基因植株。丁群星等利用微玻璃针注射授粉后10～20h  的玉米子房，将苏云金芽孢杆菌  (Bt)  杀虫蛋白基因转入玉米，获得了可育的转基因植株。王国英等利用基因枪轰击玉米悬浮细胞系、未成熟胚和胚性愈伤组织，将  Bt  基因和  bar  基因转入了玉米。Ishida  等利用农杆菌介导法转化玉米自交系  A188  未成熟胚，获得了大量转基因植株，建立了农杆菌介导法转化玉米的技术体系。张宏等利用超声波法转化玉米，获得了转基因植株。张荣等将农杆菌转化玉米的基因型拓宽到常规自交系综3、综31，张艳贞等利用农杆菌介导将  Bt  毒蛋白基因导入玉米优良自交系340和4112，平均转化率达到了2.35％。

　　综上所述，虽然在玉米转化中采用的方法有电击法、基因枪介导法、超声波法、微注射法、PEG  法和农杆菌介导法等，但基因枪介导法和农杆菌介导法应用的最为成功。授粉后18  d  左右的幼胚是普遍采用的受体材料，再生能力强，转化效果好。对农杆菌介导法而言，适宜转化的玉米基因型还比较有限，适宜的农杆菌菌系有  C58C1  和  LBA4404，共培养基中加入适量的乙酰丁香酮  (AS)、脯氨酸、谷氨酰胺等物质，有利于农杆菌侵染玉米幼胚和提高转化效率。

1.3  水稻遗传转化技术与转基因研究现状

　　80年代末期，国内外相继报道利用  PEG  法和电击法转化水稻原生质体，获得了水稻转基因植株。由于原生质体培养操作复杂，以原生质体作为转化受体，转化再生率非常低。90年代初，人们试图把双子叶植物常用的农杆菌转化技术应用到水稻转基因研究中。李宝健等首先利用农杆菌转化水稻，通过在农杆菌菌液和感染培养基中添加  AS、香草醛、没食子酸等酚类化合物的方法，在愈伤组织水平上检测到了外源基因的表达，并在电子显微镜下观察到了农杆菌对水稻细胞的粘附和侵染。Chan  等以水稻开花授粉后10～12d  的幼胚为受体，经农杆菌感染后获得了转基因植株，但同样缺乏分子生物学证据。李瑶等用农杆菌转化水稻不定芽，获得了具有  GUS  表达的转化植株，但缺乏分子生物学证据。Hiei  等以水稻成熟胚愈伤组织和未成熟幼胚为受体，获得了较多有严格分子生物学证据的转基因植株，并对农杆菌介导法转化水稻的影响因素进行了详细研究，建立了比较成熟的农杆菌转化水稻的技术体系，为农杆菌介导法转化单子叶植物开辟了先河。也为  Rashid  等利用农杆菌成功转化籼稻奠定了基础。

　　Ye  等将  β-胡萝卜素合成途径的3个基因  psy、crtⅠ、aphⅣ  导入了水稻，培育了富含维生素A  的新品系。Eunpyo  等(1989)、张宪银(2001)等、高越峰等分别将储藏蛋白基因  Glutein、球蛋白基因、高赖氨酸基因导入了水稻，转基因水稻的品质有了不同程度改进。何迎春等利用花粉管通道法将几丁质酶基因导入水稻，均获得了变异的子代，并提供了分子杂交证据。但这一方法的转化效率还比较低，在操作上还受到开花季节的限制，而且对后代的筛选工作量很大。许明辉等先后利用基因枪法将几丁质酶-葡聚糖酶双价基因转入了水稻，与受体品种相比，转基因水稻对稻瘟病的抗性显著增强。Hossan  等(1991)将3个与水稻耐淹能力有关的基因pdcⅠ、pdcⅡ、pdcⅢ  转入水稻，获得了转基因植株。村田纪夫等、高倍铁子等分别将甜菜碱生物合成酶基因  codA  和  betA  导入水稻，获得了耐盐硷性较强的转基因植株。

　　转化外源抗虫基因是水稻转基因研究中最活跃的研究领域，所利用的外源基因包括杀虫晶体蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、凝集素基因、神经毒素基因，如CryIA(b)、CryIA(c)、cpTI、GNA、AaIT  等。目前，我国已建立了农杆菌将  SCK  抗虫基因稳定转化水稻的技术体系，转化效率5％以上。Gatehouse  等报道了转雪花莲凝集素  GNA  基因水稻抗褐飞虱的研究结果。

　　抗白叶枯病基因工程育种和抗除草剂基因工程育种是水稻转基因研究中的另一个热点。Tu  等利用农菌介导法将  Xa21  基因导入了  IRF-2  等水稻品种，转基因水稻对白叶枯病的抗性明显增强。黄大年等利用基因枪法将抗菌肽基因导入了京引119水稻，转基因植株对白叶枯病具有一定抗性；将抗除草剂的  bar  基因导入了杂交水稻恢复系，由于保持系不含  bar  基因，所以杂交种苗期喷洒  Basta  除草剂，不但可以杀死杂草，而且可以去除假杂种，转基因抗除草剂水稻已进入田间试验。应用转基因技术培育新型雄性不育系，提高抗逆性，防止水稻早衰和改良水稻品质的研究正在进行中。

　　农杆菌介导的水稻遗传转化体系非常成熟，在国内外得到了广泛应用，而且不存在严格的基因型特异性，在  AAM  培养基上预培养2～3  d  的成熟胚愈伤组织和未成熟胚均可作为外源基因转移的受体材料，再生能力和转化能力都比较理想，获得成功的农杆菌菌系有  LBA4404、A281  等。基因枪介导的水稻遗传转化体系比较成熟，实际工作中的应用也比较广泛。   (责任编辑：泉水)

搜索

热门标签:

主要农作物转基因研究现状和展望