主要农作物转基因研究现状和展望(2)

1.4  小麦遗传转化技术与转基因研究现状

　　在粮食作物中，小麦属于遗传转化最为困难的作物，加上转基因研究起步较晚，基因工程育种进程明显落后于其它作物。随着基因枪的问世、新的选择标记基因和高效启动子的运用，1991年以后小麦转基因研究开始增多。Vasil  等利用基因枪介导法将  bar  基因导入了小麦，获得了世界上第一例小麦转基因植株。  Weeks  等利用基因枪介导法将  GUS  基因、bar  基因导入了小麦，建立了基因枪法转化小麦的技术体系。在随后的几年内，小麦转基因研究基本上借助于基因枪介导法。Zhou  等利用基因枪介导法将  CP4  基因和  GOX  基因导入了小麦，获得了转基因植株。Blechl  等将编码高分子量谷蛋白亚基  HMW-GS  基因导入了小麦幼胚和幼穗，获得了稳定表达的转基因植株。然而，农杆菌介导法一直是小麦遗传转化的一道难关。Cheng  等首次利用农杆菌介导法将  GUS  基因和  nptⅡ  基因转入了小麦，获得了小麦转基因植株，并对转基因植株  T0  代-T2  代进行了分子检测。夏光敏等、叶兴国等利用农杆菌介导法将  nptⅡ、bar  等外源基因转入小麦，获得了转基因植株。2001年以来，小麦转基因研究的重点由转化体系建立转为功能基因转移。Zhou  等利用农杆菌介导法将抗除草剂的  Roundup  基因转入了小麦品种  Bobwhite，培育了  Roundup  Ready  小麦，转基因小麦对除草剂表现很强抗性，已完成生产试验，等待产业化。徐惠君等利用基因枪介导法将  Nib8  复制酶基因导入了小麦，徐琼芳等、梁辉等分别利用基因枪介导法将  GNA  基因导入了小麦，转基因小麦对黄花叶病毒病、蚜虫表现较强抗性，目前已进人环境释放阶段。作者利用农杆菌介导法将  GCE、Bcl、Rip  基因导入了小麦，中间试验结果表明转基因小麦对赤霉病表现出一定抗性。

　　到目前为止获得小麦转基因植株的报道中，基因枪法占90％左右，其它方法仅占10％，包括农杆菌介导法、花粉管通道法、低能氩离子束介导法等。由于农杆菌介导法的优点，人们对此项研究一直坚持不懈。2003年  Khanna  等通过构建超级双元表达载体  HK21  和在培养基中加入多胺类化合物，转化效率达到了1.2％～3.9％；Hu  等以来源于农杆菌的抗除草剂基因  EPSPS  为选择标记，以草丁膦为筛选剂，将  EPSPS  基因导入了小麦品种  Bobwhite，转化效率达到了4.3％。Cheng  等认为农杆菌感染后对外植体进行干燥处理可显著提高  T-DNA  转运水平和转化效率。

　　小麦转基因研究大多采用授粉后13～14  d  的幼胚为受体材料，表达载体构建中普遍采用  Ubi、E35S  等启动子和  bar、nptⅡ、EPSPS  等筛选标记基因，筛选剂一般使用  Bialaphos、Glufosinate、G418  和  Glyphosate  等，成功利用的农杆菌菌系包括  ABI、Agl1、c58C1、LBA4404  和  CP4  等。总之，小麦转基因研究涉及报告基因或标记基因较多，目的基因较少，所用的受体基因型大多是  Bobwhite。因此，拓宽小麦遗传转化的受体范围，完善农杆菌转化小麦的技术体系，将一些控制抗病、优质、抗逆和抗虫的外源基因导入小麦，是今后小麦转基因研究的重点。

2  转基因农作物产业化

2.1  转基因农作物在全球的种植

　　自1986年首例转基因植物被批准进入田间试验以来，国际上已有30个国家批准了数千例转基因植物进入田间试验，涉及的植物种类达40多种。1994年转基因番茄在美国批准上市，1995年转基因棉花获准商业化生产，转基因油菜在加拿大获准大田推广，1996年转基因玉米在美国开始商业化种植，1996年全球转基因作物种植面积达到170万公顷。1999年转基因大豆在美国批准上市，转基因作物在全球种植面积2000年发展到4420万公顷，比1996年增加了25倍。2001年转基因玉米在美国开始大面积种植，转基因大豆发展到巴西、阿根廷等国家，转基因作物在全球种植面积2004年增加到8100万公顷，比2003年增加了19.7％，比1996年增加了近47倍。目前为止，有7个转基因植物获准在18个国家商业化种植，除大豆、玉米、棉花、油菜等主要农作物外，还包括番茄、矮牵牛、甜椒、南瓜和木瓜。其中，转基因大豆的种植面积最大，占全球转基因植物总面积的60.0％，其次是转基因玉米、转基因棉花和转基因油菜。就全世界而言，美国是种植转基因作物面积最大的国家，占全球转基因作物总面积的59.0％，其次是阿根廷、加拿大、巴西和中国。美国是种植的转基因作物主要是大豆、玉米等，阿根廷和巴西种植的转基因作物主要是大豆，加拿大种植的转基因作物主要是油菜，中国种植的转基因作物主要是棉花。按转基因作物类型划分，抗除草剂类型占73.0％，主要是转基因大豆和油菜，抗虫类型占18.0％，主要是转基因玉米和棉花，兼抗类型占9.0％，主要是转基因，抗病毒等类型不到1.0％，主要是木瓜。

2.2  转基因农作物在国内的种植

　　在国家“863”计划和“转基因植物研究与产业化专项”等科技项目的资助下，我国转基因植物研究取得了很大进展。目前为止，共有1000多例转基因植物申报了安全性评价，批准了近800例，其中，批准中间试验450多例，批准环境释放200例左右，批准生产性试验50多例，包括转基因水稻、棉花、玉米、油菜、马铃薯、大豆、小麦等30种植物。耐储藏番茄、观赏矮牵牛、观赏矮牵牛、保铃棉、抗虫棉、抗病毒甜椒、抗病毒番茄等转基因植物被批准进行商品化生产。我国种植面积最大的转基因作物是抗虫棉，2002年种植面积为200万公顷，2003年种植面积为280万公顷，2004年发展到了370万公顷。但是，与国际先进水平相比我国转基因研究还有一定差距，转基因作物的的种植面积只占全球的5％，涉及的转基因作物主要是棉花。

2.3  转基因农作物产生的经济效益

　　转基因作物的推广在全球产生了可观的经济效益，不但大幅度减少了农药使用量，有效控制了害虫和杂草，减轻了环境和农产品污染，而且显著提高了作物产量，增加了农民收入。据  ISAAA  估算，转基因作物种子在全球范围内的市场年交易额从最初的1.5亿美元增加到近几年的30多亿美元。美国种植转基因大豆的收益每公顷增加了约50美元，种植转基因棉花的收益每公顷增加了约40美元，种植转基因玉米的收益每公顷增加了20多美元。从美国和加拿大种植转基因玉米的情况看，对玉米螟的控制效果十分突出。抗虫玉米与同品种非转基因对照比，平均增产7％～9％。全球仅  Bt  棉花的推广种植节约了33000多吨杀虫剂，减少了约40％，2001年美国种植的6种转基因作物减少杀虫剂使用量23000多吨，不但降低了生产成本，而且保护了环境。1996～2003年我国抗虫棉的累计种植面积达到了480万公顷，国产抗虫棉品种的市场份额由1998年的10％上升到2002年的64.4％，棉农增加收益20多亿元，每年每公顷平均增收700多元。

3  农作物转基因研究的问题与展望

3.1  转化方法运用和转化体系建立

　　农杆菌介导法是应用最广泛的植物转基因方法。在自然条件下，农杆菌只侵染双子叶植物，不侵染单子叶植物。所以，早期人们认为农杆菌介导的转化方法不能用于单子叶植物。由于农杆菌转化法具有转化效率高、外源插入片段明确、单拷贝整合等优点，许多研究者一直在探索用农杆菌转化禾谷类粮食作物。近几年来，尽管已经建立了主要粮食作物农杆菌介导的转化体系，但转化效果极大地依赖于物种、基因型、外植体以及其它一些未知因素。尤其是小麦和玉米，基因型、外植体的要求比较严格。进一步提高这两大作物的转化频率，建立不受基因型限制的高效转化体系。

　　基因枪介导法在小麦中应用的最多，其次是玉米和水稻。但基因枪介导法存在转化效率比较低，插入外源  DNA  的片段大小不明确，多拷贝整合比较多，容易发生基因沉默现象，不能导入大片段  DNA  等缺点，而且成本高，操作比较复杂。在实际应用中有一定局限性。

　　花粉管通道法在我国有很多成功的事例，先后获得了小麦、棉花、玉米、水稻、大豆等转基因植株，有些转基因品种已进入产业化生产，具有很强的实用性。花粉介导转化法是花粉管通道法的拓展，在一些植物上有成功的报道。但是，花粉管通道法获得的转基因植株缺乏严格的分子生物学证据，理论依据不充足，有待加强这方面的研究。

　　建立简单、高效的转化体系对于主要农作物转基因研究具有重要意义。活体植株农杆菌浸花转化法在拟南芥中应用的非常有效，种子成熟后在选择培养基上萌发或苗期喷洒选择剂，即可获得转基因植株。如果能将这种方法成功用于主要农作物，将绕过组织培养环节，有利于转基因技术的普及。

3.2  提高主要农作物转化效率的策略

　　组织培养和植株再生途径是植物转基因研究的基础。在主要禾本科作物中，农杆菌转化水稻的技术体系最为成熟，原因可能在于水稻转化多以成熟胚为受体材料，不但再生能力强，而且取材方便。小麦、玉米等作物的转基因研究大多以未成熟胚为受体材料，存在强烈的基因型特异性，建立成熟胚高频率再生体系和筛选对农杆菌敏感的基因型，对于提高小麦、玉米等作物的转化效率具有促进作用。经过近2年的研究探索，我们利用农杆菌转化小麦成熟胚愈伤组织首次获得了转基因植株，为进一步提高小麦农杆菌转化效率提供了新途径。

　　农杆菌-植物细胞间的信号传导和互作是实现植物基因转移的关键步骤。小麦、玉米、水稻等单子叶植物对农杆菌不敏感，改良共培养过程的外界环境、筛选适宜的农杆菌菌系和受体基因型等可促进  T-DNA  的剪切和转移。同时，通过将  VirGN54D  等调节基因转入农杆菌供体和  VIP1  等结合蛋白基因转入植物受体，可诱导  Vir  基因的集体表达，提高  T-DNA  的细胞间转移水平，以及向细胞核的运输和向染色体上的整合，对于提高农杆菌转化效率具有较大潜力。另外，构建高效表达载体不但有利于外源基因的表达，也有利于转化细胞的筛选，启动子串联策略和增强子优化可避免外源基因导入后的低效表达和沉默现象。

3.3  功能基因转移和应用

　　从获得第一例转基因植株到现在，已经有多种基因转移到多种植物当中的报道，涉及到抗病毒、抗真菌、抗虫、抗除草剂、抗旱、改善品质等性状。但是，从目前产业化利用的转基因植物来看，真正具有应用价值的转基因植物主要有两类，一是转  Bt  基因的抗虫植物，二是转  Roundup  基因和  EPSPS  基因或  bar  基因的抗除草剂植物，其他多数转基因植物没有在生产实践中发挥预期的作用，其原因是所转移的基因功能不强。所以，应加强有重要利用价值基因的挖掘和克隆工作，进一步将其转入主要农作物，推动农业增产、农民增收。

3.4  转基因植株检测和功能鉴定

　　转基因植株获得后进行严格的分子生物学检测和科学的功能鉴定，有利于转基因植物的推广。在对转基因植株进行  PCR、ELISA、叶片涂抹除草剂等初步鉴定的基础上，进行  Southern、Northern、Western  等鉴定，检测功能基因的整合、转录和表达。尤其对于农杆菌介导法获得的转基因植株，由于  T0  植株内农杆菌的存在，PCR  检测结果有一定程度的假阳性。功能鉴定要在严格控制的条件下进行，设置重复和对照。   (责任编辑：泉水)

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