世界各国微生物发酵法生产天然香兰素工艺导读

        香兰素，又名香草素、香草醛或香兰醛，化合物名称为4-羟基-3-甲氧基苯甲醛，化学物质登记号121-33-5。香兰素是香子兰制品中的重要组成成分，作为一种广谱型高档香料，广泛应用于食品、烟草及医药工业。香兰素的世界年消费量约1.2万吨，而天然香兰素的产量仅为1800吨，因此远不能满足需求。由于人们对天然品需求愿望的增强及生产天然香兰素巨大的商业利益，天然香兰素的获取已成为近年来的研究热点。



        根据FDA规定，只要原料是天然的，通过生物催化法(酶作用)获得的香料就是天然的。香兰素的生物合成方法主要有微生物发酵、酶工程、细胞工程等。但是综合考虑技术可行性、经济性、安全性等因素，微生物发酵法被认为是目前最实际的天然香兰素制取方法。许多细菌和真菌都可用来生产香兰素，这些微生物以阿魏酸、丁子香酚、异丁子香酚、香草醇等化合物为前体，发酵获得香兰素。作者对世界各国微生物发酵法生产天然香兰素工艺进行了文献调研，现将有关的工艺方法及其效果介绍如下。首先关注德国、法国、瑞士三个国家在这方面的研究进展。



        （一）德国



        2003年德国Muenster大学Overhage,  Joerg等人以重组的大肠杆菌E.  coli  XL1-Blue(pSKvaomPcalAmcalB)将丁子香酚转化成阿魏酸，30-L规模生物转化，总发酵30小时后，阿魏酸的最大浓度为14.7  g/L，摩尔产率93.3%（以丁子香酚计）。然后加入大肠杆菌E.  coli(pSKechE/Hfcs)，使阿魏酸转化成香兰素(J.  Overhage,  H.  Priefert,  and  A.  Steinbuechel,  Appl.  Environ.  Microbiol.  65:4837-4847,  1999)，香兰素产率为0.3  g/L。



        2000年德国Muenster大学Achterholt,  S.等人对无枝酸菌HR  167的基因进行了研究，这个菌株含有烯酰CoA水解酶/醛缩酶(ech)，和feruloyl-CoA合成酶(fcs)。将这个基因片断放在4000bp  PstI片断(P40)上。再在大肠杆菌中表达。结果发现重组后的大肠杆菌降解阿魏酸的途径与萤光假单孢杆菌AN  103和假单孢杆菌HR199相似。这说明无枝酸菌HR  167也具有将阿魏酸转化成香兰素的特性。无枝酸菌HR  167的代谢途径如下：阿魏酸→阿魏酰→CoA→4-羟基，3-甲氧基丙酶-CoA→香兰素→香兰酸。



        1999年德国哈尔曼及赖默股份有限公司申请的中国专利CN99812907.0揭示了一种转化的和/或诱变的单细胞或多细胞生物，其特征在于丁子香酚和/或阿魏酸分解代谢的酶被灭活，使得中间产物松柏醇，松柏醛，阿魏酸，香草醛和/或香草酸积累。



        1996年德国哈尔曼及赖默股份有限公司申请的美国专利US6133003利用土壤丝菌DSM  9992菌株将阿魏酸转化成香兰素，32小时后，产量达11.5g/L，理论转化率为77.8％。



        （二）法国



        丝状真菌黑曲霉(Aspergillus  niger)利用阿魏酸为前体物质将其转化为香兰酸，朱红密孔菌(Pycnoporus  cinnabarinus)再将香兰酸转化为香兰素，此法称为两步法。1999年法国农业科学研究院（INRA）Bonnin,  Estelle等人利用甜菜作为阿魏酸产生的原料，利用甜菜渣子作为纤维二糖产生的原料，使产量比没有加入纤维二糖的培养基产量提高3.3倍(764mg/L)，而同时用工业纤维二糖作为催化剂可比没有加入纤维二糖的培养基提高3.1倍(725mg／L)。



        1999年法国Oddou,  J.等人单独利用朱红密孔菌(Pycnoporus  cinnabarinus)作为出发菌株，并利用不同的碳源选择它的高密度培养基，以阿魏酸为前体物质代谢产生香兰素。结果:得到菌株体的生物量对于产量有着至关重要的影响，以葡萄糖和磷脂混合作为碳源得到的菌丝体的生物量最高，相应的产量最大，达到760mg／L。



        （三）瑞士



        1999年瑞士Givaudan  Roure  Research  Ltd.的Muheim,  A等人利用西唐氏链霉菌(Streptomyces  setonii)，以阿魏酸代替有毒的丁香酸作为前体物质产生了香兰素。具体生产步骤如下：西唐氏链霉菌在基本培养中摇床培养→16h以后加入阿魏酸继续培养→离心收集菌体→破壁→提取酶→加入阿魏酸反应→处理培养基样品→HPLC法测定样品中的香兰素的含量。摇瓶试验结果表明西唐氏链霉菌可以产生6.4g/L的香兰素，摩尔产率为68％。



        参考文献



        1.Overhage,  Joerg;  Steinbuechel,  Alexander;  etc.  Highly  efficient  biotransformation  of  eugenol  to  ferulic  acid  and  further  conversion  to  vanillin  in  recombinant  strains  of  Escherichia  coli.  Applied  and  Environmental  Microbiology,  69(11),  6569-6576,2003 (责任编辑：泉水)

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