待检测样品制备

　　生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，必须将样品进行生物处理。从血液或活组织中获取的DNA/mRNA样品在标记成为探针以前必须扩增以提高阅读灵敏度，但这一过程操作起来却有一定的难度。比如在一个癌细胞中有成千上万个正常基因的干扰，杂合癌基因的检测和对它的高效、特异地扩增就不是一件容易的事。因为在一般溶液中PCR扩增时，靶片段太少且不易被凝胶分离，故存在其它不同的DNA片段与其竞争引物的情况。美国Mosaic Technology公司发展了一种固相PCR系统。此系统包含两套引物，每套都可以从靶基因两头延伸。当引物和DNA样品及PCR试剂相混时，如果样品包含靶序列，DNA就从引物两头开始合成，并在引物之间形成双链DNA环或"桥"。由于上述反应在固相中产生，因而避免了引物竞争现象，并可减少残留物污染和重复引发。

　　根据样品来源、基因含量、检测方法和分析目的不同，采用的基因分离、扩增及标记方法各异。为了获得基因的杂交信号必须对目的基因进行标记。标记方法有荧光标记法、生物素标记法、同位素标记法等。目前采用的最普遍的荧光标记方法与传统方法如体外转录、PCR、逆转录等原理上并无多大差异，只是采用的荧光素种类更多，这可以满足不同来源样品的平行分析。

　　样品制备的常用试剂：对于检测表达的芯片，样品制备通常涉及（m）RNA的纯化，cDNA的合成，体外转录或者PCR，标记等步骤。而对于SNP或者突变检测，则往往涉及Genomic DNA纯化和PCR、标记等步骤。

　　1. RNA纯化：

　　从样品中分离纯化高质量的RNA是非常重要的第一步。由于RNA样品中的DNA碎片会影响后继的PCR反应，所以要彻底除去样品中的DNA。通常用mRNA纯化的方法可以除去DNA片断，或者用RNase-Free的DNase处理RNA样品。在这里我们介绍一些常用的RNA纯化试剂盒，特别是由Affymetrix公司推荐的QIAGEN RNA纯化系列。

　　* RNeasy Protect Kit：

　　一旦生物样品被收集分离，它的RNA会立刻变得非常不稳定，极易被降解。由于特异及非特异的RNA降解，或者由于应激反应产生新的RNA都会引起RNA状态的改变。对于生物芯片、基因表达矩阵分析（Array Analysis）、定量RT-PCR等实验来说，采样后立即稳定样品里的RNA以保存当时RNA的表达状态，是精确/定量研究基因表达分析的重要前提。为了达到这个目的，往往需要将液氮或者干冰带到采样现场，采样后立即抽提RNA或者运回实验室保存。对于实验者来说非常不方便。

　　著名的QIAGEN公司最近新推出一种RNA抽提试剂：RNeasy Protect Kit，提供一整套RNA保护和分离试剂，从样品的制备到RNA的抽提，只需一个试剂盒即可解决所有问题。保证样品的表达信息不受破坏，确保得到可信的基因表达分析结果。

　　试剂盒里提供一种RNAlater RNA Stabilization Reagent，只要在采样后立即将新鲜样品浸入这种液体试剂，RNA保护剂可以迅速渗透到组织或其他生物样本中，稳定并保护RNA完整而不被降解，确保下游分析得到的数据真实反应样品的表达信息。保存在RNAlater中的样品RNA可以在37度下稳定保存1天，或者在18-25度保存7天，2-8度稳定4周，或者在-20度永久保存。这种技术为在不同温度下采样，运输和保存样品提供了极大的方便，特别适用于各种动物组织、培养细胞、细菌、白细胞，但必须说明的是它不适用于全血或体液中RNA的保存。

　　RNAlater的用法非常简单，只要在采样后立即将样品完全浸入适量（10ul/1mg组织）的RNAlater中即可。取样的动作要尽量快速利索，组织样品的大小以不超过0.5公分厚为宜，对于一些小的组织如小鼠的脾、肾等器官则可以整个取出浸入溶液中，较大的则应切开为厚度小于0.5公分的小块，以确保RNAlater 能迅速扩散渗透入组织块中的所有细胞中。采样的容器应该足够大以容纳10倍于组织重量的溶液，避免组织块挤在一起，同时建议将溶液加满容器以避免在运输过程中组织块露出液面。注意本试剂只适用于新鲜样品，对于冷藏和包埋的样品直接抽提RNA即可。另外对于RNA已经降解的样品，RNAlater只能保护剩下的样品RNA，不能修复已破坏的RNA。

　　保存后的样品可以直接用于RNA或者mRNA的抽提。RNAlater不会影响组织块的结构，可以在室温下切出适量的组织块用于称量和抽提RNA，剩下的部分可用于继续保存样品。-20度冻存的样品可以取出在室温下进行称量等操作而无需干冰。在-20度冻存的样品反复冻融20次RNA依然保持完好无损。RNAlater处理的样品比新鲜组织稍微硬一点，但不会影响匀浆过程。取出适量的样品即可开始加RLT缓冲液进行匀浆化。

　　和传统的RNeasy Kit一样，RNeasy Protect Kits采用QIAGEN著名的硅胶膜纯化柱技术，迅速特异地吸附样品裂解液中的RNA，无需酚氯仿抽提，不用乙醇沉淀或LiCl沉淀，也不用CsCl超离，只要洗脱即可得到纯的RNA。通常情况下RNeasy的纯化技术足以除去绝大部分的DNA，而无需额外进行DNaes处理，但是对于一些对痕量DNA非常敏感的实验，用RNase-Free DNase Set（QIAGEN cat.no. 79254）可以直接在纯化柱上消化DNA残留，在随后的洗涤步骤中除去DNase，最后洗脱得到不含DNA的纯RNA。

　　试剂盒具有以下优点：

　　·迅速稳定并保护RNA，确保基因完整、基因表达信息可靠。

　　·由于RNA Stabilization试剂，您可以放心地在室温下操作，方便、安全--无须液氮和干冰。

　　·确保RNA不受降解--即使多次冻溶也不受影响。

　　·简单、快速和可靠RNA分离--使用于所有下游分析的即用型RNA。

　　货号 品名（规格） 价格（RMB）

　　74124 RNeasy Protect Mini Kit(50) 3181.00

　　75152 RNeasy Protect Midi Kit(10) 1313.00

　　75182 RNeasy Protect Maxi Kit(12) 4140.00

　　76104 RNAlater RNA Stabilizationeagent 682.00

　　* QIAGEN RNeasy Total RNA纯化系列（Affymetrix推荐！）

　　采用QIAGEN著名的硅胶膜纯化柱技术，迅速特异地吸附样品裂解液中的RNA，无需酚氯仿抽提，不用乙醇沉淀或LiCl沉淀，也不用CsCl超离，只要20分钟（Mini Kit）到1小时（Maxi Kit）即可直接从样品中提取高质量的Total RNA。以下是部分产品信息，更大的包装信息或者详细操作手册欢迎致电基因有限公司或者点击产品名称查看。

　　货号 品名（规格） 价格（RMB）

　　74104 RNeasy Mini Kit (50)

　　75142 RNeasy Midi Kit (10)*

　　75162 RNeasy Maxi Kit (12)*

　　74903 RNeasy Plant Mini Kit (20)

　　* QIAGEN Oligotex Direct mRNA纯化系列 （Affymetrix推荐！）

　　Direct系列产品无需酚氯仿抽提，不用乙醇沉淀或LiCl沉淀，也不用CsCl超离，不到30分钟可直接从样品中纯化出高质量的mRNA，可用于各种常规应用以及芯片分析，显微注射，建库，消减杂交，SAGE技术等要求很高的的实验。回收率高达90%以上。以下是部分产品信息，更大的包装信息或者详细操作手册欢迎致电基因有限公司或者 到生物通商城查询。

　　货号 品名（规格） 价格（RMB）

　　72012 Oligotex Direct mRNA Micro Kit

　　72022 Oligotex Direct mRNA Mini Kit

　　72041 Oligotex Direct mRNA Midi/Maxi Kit

　　70022 Oligotex mRNA Mini Kit

　　70042 Oligotex mRNA Midi Kit

　　70061 Oligotex mRNA Maxi Kit

　　* QIAamp RNA Blood Mini Kit

　　专为从新鲜全血中快速提取高质量的RNA而设计，专利设计的QIAshredder和QIAamp离心纯化柱让你彻底摆脱酚氯仿抽提和离心沉淀的苦恼，简便快速地纯化出适用于各种用途的优质RNA。 QIAamp Viral RNA Mini Kit则适用于从各种无细胞的体液、血清、尿液、CSF中分离RNA，回收率高达90%以上。

　　货号 品名（规格） 价格（RMB）

　　52304 QIAamp RNA Blood Mini Kit(50)

　　52904 QIAamp Viral RNA Mini Kit (50)

　　* Clontech公司的Atlas Glass Total RNA Isolation Kit是专为Clontech公司的Atlas Glass

　　Microarray设计的RNA纯化试剂盒。由于Clontech公司认为离心柱式的RNA纯化系统纯化的样品RNA在制备探针会在Atlas Glass Microarray上有较高的背景，因而特别设计用硫氰酸胍/酚抽提制备适用于Atlas Glass Microarray样品RNA以便进行下一步的荧光/同位素标记。

　　2. Genomic DNA的分离纯化：

　　对于Genotyping、SNP分析和Genomic Chip来说，要检测基因组或者染色体上的突变就需要制备样品的基因组DNA而非RNA以进行检测。在这里简单介绍几个常用的试剂盒，有关详细资料和操作手册欢迎致电基因有限公司或到生物通商城查询。

　　* QIAamp System（Affymetrix推荐！）

　　QIAGEN公司专利的样品纯化技术方便快速从多种临床样品中纯化高质量的Genomic DNA，无需酚氯仿抽提和乙醇沉淀。根据不同的样品来源可以选择特定的试剂盒。

　　货号 品名（规格） 价格（RMB）

　　51104 QIAamp DNA Blood Mini Kit(50)

　　51183 QIAamp DNA Blood Midi Kit(20)

　　51192 QIAamp DNA Blood Maxi Kit(10)

　　51304 QIAamp DNA Mini Kit(50)

　　51504 QIAamp DNA Stool Mini Kit(50)

　　DNeasy System 是QIAGEN公司为除临床样本以外的其他样本，如动物组织、血液、酵母、细菌、植物等快速制备基因组DNA而设计的，采用硅胶膜技术，无需酚氯仿抽提和乙醇沉淀。单个离心柱或96孔纯化板满足不同的需求。 欢迎直接到生物通商城查询更多有关产品的信息.

　　货号 品名（规格） 价格（RMB）

　　69504 DNeasy Tissue Kit(50)

　　69103 DNeasy Plant Mini Kit(20)

　　69104 DNeasy Plant Mini Kit(50)

　　68161 DNeasy Plant Maxi Kit(6)

　　3. 探针的制备和标记：

　　对于表达芯片分析，常用的有以下几种方法制备和标记探针：将纯化的样品RNA通过特定的引物逆转录合成单链cDNA探针，在合成的过程中掺入标记物；或者先将待测样品的RNA转录合成cDNA，再进一步通过加入标记物进行体外转录合成cRNA单链探针，又或者将合成的cDNA加标记物和特殊引物进行PCR扩增，制备成标记的双链探针。而对于SNP芯片和突变检测，则需要将纯化的基因组DNA用特定的引物扩增并进行标记。由于不同的DNA Array供应商对于标记有不同的要求，我们在下面分别介绍。

　　1）Affymetrix的表达芯片：

　　要求制备样品的cRNA探针。为保证制备出足够的cRNA用于杂交和每一步的样品分析，Affymetrix公司推荐用1μg以上的mRNA（最少0.2μg以上）或者5μg以上的总RNA开始合成cDNA。以HPLC纯的T7-(dT)24 Primer(推荐选用GENSET公司的产品，要求是HPLC纯的，PAGE胶纯化的引物在这里不适用)作为逆转录引物合成cDNA。由于引物中带有T7序列，因此合成的cDNA的3'端也带有T7序列。选用Affymetrix公司提供的Enzo？ BioArray？ HighYield？ RNA Transcript Labeling Kit(Cat.No.900182,10次标记)，通过试剂盒提供的生物素标记的核糖核酸和T7 RNA聚合酶，以体外转录（IVT）的方式扩增并标记cRNA探针。试剂盒提供体外转录和标记的所有试剂，可以作10个反应。标记好的探针经过随机片断化（fragmentation，试剂自行配制）后得到大小约为35-200个碱基大小的RNA片断即可和芯片进行杂交。