分子生物学课程教学讲义 朱玉贤(10)
时间:2005-12-30 20:56来源:Internet 作者:bioguider 点击:
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1957 A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。
1958 M. Meselson和F. W. Stahl提出了DNA的半保留复制模型。
1959-1960 S. Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA,并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。
1961 Nirenberg破译了第一相遗传密码;F. Jacob和J. Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。
1964 C. Yanofsky和S. Brenner等人证明,多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。
1965 S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定;科学家证明细菌的抗药性通常由"质粒"DNA所决定。
1966 M.W.Nirenberg,S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破译了全部遗传密码。
1970 H.O.Smith,K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。
1972-1973 H.Boyer,P.Berg等人发展了DNA重组技术,于72年获得第一个重组DNA分子,73年完成第一例细菌基因克隆。
1975-1977 F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。1977年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。
1978 首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。
1980 美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。
1981 R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠;A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。
1982 美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素;Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。
1983 获得第一例转基因植物。
1984 斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。
1986 GMO首次在环境中释放。
1988 J. D. Watson出任"人类基因组计划"首席科学家。
1989 DuPont公司获得转肿瘤基因小氧--"Oncomouse"。
1992 欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定(315kb)
1994 第一批基因工程西红柿在美国上市。
1996 完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。
1997 英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。
基因工程中常见的名词:
遗传工程--genetic engineering,基因操作--gone manipulation,基因克隆--gone cloning,
重组DNA技术--recombinant DNA technology,分子克隆--molecular cloning。
基因工程的主要内容或步骤:
1. 从生物有机体基因组中,分离出带有目的基因的DNA片段。
2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上,形成重组DNA分子。
3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(亦称寄主细胞)并与之一起增殖。
4. 从大量的细胞繁殖群体中,筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞,并筛选出已经得到扩增的目的基因。
5. 将目的基因克隆到表达载体上,导入寄主细胞,使之在新的遗传背景下实现功能表达,产生出人类所需要的物质。
二、 基因操作的主要技术原理
1. 核酸的凝胶电泳(Agarose & Polyacrylamide)
将某种分子放到特定的电场中,它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率,它与电场强度成正比,与该分子所携带的净电荷数成正比,而与分子的磨擦系数成反比(分子大小、极性、介质的粘度系数等)。
在生理条件下,核酸分子中的磷酸基团是离子化的,所以,DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态(Polyanions)。将DNA、RNA放到电场中,它就会由负极→正极移动。
在凝胶电泳中,一般加入溴化乙锭(EB)--ethidium bromide染色,此时,核酸分子在紫外光下发出荧光,肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。
DNA的脉冲电泳技术 :PFGE-Pulse-field gel electrophoresis
2. 核酸的分子杂交技术
在大多数核酸杂交反应中,经过凝胶电泳 分离的DNA或RNA分子,都是在杂交之前,通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地"吸印" 转移到滤膜上的。常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜,叠氮苯氧甲基纤维素滤纸(DBM)和二乙氨基乙基纤维素滤膜(DEAE)等。
核酸分子杂交实验包括如下两个步骤:
将核酸样品转移到固体支持物滤膜上,这个过程特称为核酸印迹(nucleic acid blotting)转移,主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting);
将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。
3. 细菌的转化
所谓细菌转化,是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA,而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株,而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化DNA之前,必须预先用CaCl2处理大肠杆菌细胞,使之呈感受态(Competent Cells)。Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作用,质粒DNA中的抗生素是筛选标记。
对绝大多数hsdR-,hsdM-突变体菌株(k12),每ug DNA可得107-108个转化子。
4. DNA序列分析
a. Sanger的双脱氧链终止法
Cambridge的F. Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列,其基本原理如下:
①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板,合成准确的DNA互补链;②该酶能够用2',3'--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3'-末端,从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中,加入模板DNA,引物(特异性引物,如T7,T3,M13等),DNA聚合酶,dA,dT,dG,dC和一种ddNTP。常用Klenow大片段,无5'→3'外切酶活性。
b. Maxam-Gilbert化学修饰法(哈佛大学)
该方法的基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段,造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物,经凝胶电泳分离和放射自显影之后,可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。
该反应的关键在于使DNA的4种核苷酸中,只有1-2种发生特异性的化学切割反应:
碱基的特异性修饰;
被修饰的碱基从核糖环上转移;
失去碱基的糖环部位发生DNA链断裂。
专门用来对核苷酸作化学修饰,并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫酸二甲酯(dimethylsulphate)和肼(hydrazine)。
硫酸二甲酯是碱性化学试剂,能使DNA链中鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N6位发生甲基化,在中性PH环境中就能使糖苷键发生水解,并引起DNA链的断裂。在碱性条件下,肼能特异性切割C和T。如果加入1 mol/L的Nacl,那么,只有C被特异性切割。
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