分子生物学课程教学讲义朱玉贤(11)

c． DNA序列分析自动化用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作为荧光剂标记DNA引物，带有这种引物的DNA片段能在激光诱导下发出荧光。按照标准的双脱氧终止法或化学终止法进行测序反应，跑DNA凝胶后用计算机检测。 d.DNA杂交测序法(SBH-Sequencing by hybridization) 如果一段较短的DNA探针能与较长的DNA片段杂交，并形成完全的双链结构，我们就推测在靶DNA上存在着相应的互补序列，这就是DNA杂交测序法的基本原理。如果将一种12-mer的靶DNA与完全随机合成的8-mer寡核苷酸控针混合杂交，在总数为48=65536种8-mer的控针群体中，仅有5种探针会与靶DNA杂交，形成完全互补的双链分子。当靶DNA与标记探针形成G-T或G-A末端碱基错配的双链体时，检测有一定难度。寡核苷酸探针越短，碱基错配造成的去稳定效应越明显，较易与完全的双链体分子相区分。但是，探针短，杂交产物的总体稳定性下降，信/噪比下降，影响结果的可靠性。所以，6-mer寡核苷酸矩阵芯片只能用于测定500bp的靶DNA；7-mer=2000bp，8-mer=8000bp。 SBH的应用： ① 可有效检测靶DNA中的单碱基突变； ② 可用于不同DNA片段之间的序列比较； ③ 可用于检测不同生长发育状态下细胞中特定基因的表达状况； ④ 可用于检验传统测序技术的准确性。 5．基因的定点诱变（site-directed mutagenesis）使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。 a. 盒式诱变(cassette mutagenesis)，包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。 b．寡核苷酸引物诱变应用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段做引物，进行DNA复制，使寡核苷酸引物成为新合成的DNA子链的一个部分。 C．PCRG与PCR诱变 6．利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究. a.凝胶滞缓实验(Gel retardation assay)，又称DNA迁移率变化试验(DNA mobility shift assay--EMSA)。 b． DNase I 印迹试验（DNase I foot printing）主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使DNA链发生断裂。这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键，要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）； ⑤进行DNA凝胶分析。如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合，那么，它就会保证该区段DNA免受消化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记的条带。 c．甲基化干扰试验(Methylation interference assay) 用DMS处理靶DNA，使平均每条链上只有一个G被甲基化。将局部甲基化的DNA与含DNA结合蛋白的细胞提取物共温育后进行凝胶滞缓试验。分离各种DNA条带，并用六氢吡啶切割甲基化的残基。如果因某个G残基的甲基化作用而阻止了蛋白质与DNA的结合，那么，六氢吡啶对这个甲基化G残基的切割作用，就只能在没有蛋白质结合的DNA中观察到。 d．体内足迹试验用适量DMS处理完整的游离细胞，使染色质中的G残基甲基化，提取DNA并加入六氢吡啶切割DNA链。与对照的裸露DNA经甲基化处理后形成的梯度相对照，就能发现DNA链上的蛋白质结合区。三、分子克隆技术 1、高质量mRNA的制备应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System分离Poly(A)RNA。将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。 2．反转录成cDNA 可同时在反转录系统中加入Oligo（dT）12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA；应选用活性较高的反转录酶（Reverse transcriptase）；应选用甲基化dCTP；应保证所获得双链cDNA的方向性。 Super Script Choice cDNA合成系统中所用的poly（dT）引物因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5'-methyl C的外源DNA，所以，应选用mcrA- mcrB-菌株。 3．分子克隆的主要方法（1）构建cDNA、核DNA文库，应用现有核酸探针分离新的目的基因；（2）差式杂交(differential screen)和扣除杂交(subtractive hybridization)技术；（3）DD-RT-PCR法及差别显示技术；（4）差别分析法 (RDA法，即Representational difference analysis）；（5）酵母双杂交体系Two-hybrid system；（6）图位克隆法（map-based cloning）与染色体步移（genomic DNA Walking）。习惯上，人们用克隆表示由同一物种具有相同基因型的两个或多个个体组成的群体。所以，从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotic twins）便属于同一克隆。细胞学上，克隆是指由同一个祖细胞（progenitor cell）分裂而来的具有同一遗传背景的子细胞群体。分子生物学上，把将外源DNA插入具有自主复制能力的载体DNA中，使之得以自主复制和永久保存的过程叫做分子克隆。文库筛选与基因丰度有关。高丰度基因，如蚕丝心蛋白，卵清蛋白等在某些特定组织中可占细胞总mRNA量的50-90%，非常容易被分离。低丰度基因，一般在细胞中只有10-20个拷贝，哺乳动物细胞中可含10,000到40,000种不同的mRNA，如果要达到99%的期望值，大约需要筛选150,000-170,000个克隆子。一般情况下，每微克cDNA可产生10万-60万个克隆子。 A.差式杂交或扣除杂交克隆技术 B.cRNA差式显示法除了极少数特例(如组蛋白基因)之外，几乎所有的真核基因mRNA分子的3'-末端，都带有一段多聚的腺苷酸结构，即通常所说的poly(A)尾巴。 P.Liang等人设计合成了全部12种不同的引物，用以反转录mRNA，合成第一链cDNA。这种引物通常叫作3'-端锚定脱氧核苷酸引物，并用5'-T11MN或5'-T12MN通式表示。其中M为除了T以外的任何一种核苷酸（即A、G或C），而N则为任何一种核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12种不同的排列组合方式。 DDRT-PCR的主要步骤： Ⅰ.从不同发育阶段或不同基因型的细胞群体中分离mRNA，并以3'锚定引物作为反转录的引物，合成第一键cDNA； Ⅱ.用5'随机引物和某个3'端锚定引物对扩增第一链(掺入32p-dNTP)； Ⅲ.用DNA变性测序胶分离扩增产物，X光片曝光后检测差别条带； Ⅳ.回收特异性差别条带； Ⅴ.用同一引物对扩增已回收的DNA条带； Ⅵ.用Northern，Southern及测序法分析所得的条带； Ⅶ.以该DNA片段做探针，筛选全长cDNA或核基因。 C.cDNA差式分析法(Representational ditterence analysis) RDA法充分发挥了PCR以指数形式扩增双链DNA模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异扩增了目的基因片段。因为试验对象（Tester）和供试探针（Driver）在接受差式分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长度256bp的代表群（representation）保证绝大部分遗传信息能被扩增。每次T减D反应后仅设置72℃复性与延伸，94℃复性这两个参数共20个PCR循环，PCR产物的特异性和所得探针的纯度非常高。 (责任编辑：泉水)

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