分子生物学课程教学讲义朱玉贤(4)

------------------------------------------------------ 第三讲蛋白质合成一.基因与基因表达的一般概念基因作为唯一能够自主复制、永久存在的单位，其生理学功能以蛋白质形式得到表达。DNA序列是遗传信息的贮存者，它通过自主复制得到永存，并通过转录生成mRNA，翻译生成蛋白质的过程控制所有生命现象。编码链（coding strand）又称sense strand，是指与mRNA序列相同的那条链。非编码链（anticoding strand），又称antisense strand，是指那条根据碱基互补原则指导mRNA生物合成的DNA链。 Genetic information is perpetuated by replication（复制）in which a double- stranded nucleic acid is duplicated to give identical copies. 基因表达包括转录（transcription）和翻译（translation）两个阶段。转录是指拷贝出一条与DNA链序列完全相同（除了T→U之外）的RNA单链的过程，是基因表达的核心步骤。翻译是指以新生的mRNA为模板，把核苷酸三联子遗传密码翻译成氨基酸序列、合成蛋白质多肽链的过程，是基因表达的最终目的。只有mRNA所携带的遗传信息才被用来指导蛋白质生物合成，所以人们一般用U、C、A、G这4种核苷酸而不是T、C、A、G的组合来表示遗传性状。所谓翻译是指将mRNA链上的核苷酸从一个特定的起始位点开始，按每3个核苷酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。二. 遗传密码——三联子 mRNA上每3个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这3个核苷酸就称为一个密码，也叫三联子密码。翻译时从起始密码子AUG开始，沿mRNA5’→3’的方向连续阅读直到终止密码子，生成一条具有特定序列的多肽链。 mRNA中只有4种核苷酸，而蛋白质中有20种氨基酸，若以一种核苷酸代表一种氨基酸，只能代表4种(41=4)。若以两种核苷酸作为一个密码（二联子），能代表42=16种氨基酸。而假定以3个核苷酸代表一个氨基酸，则可以有43=64种密码，满足了编码20种氨基酸的需要。 50-60年代破译遗传密码方面的三项重要成果：（1）Paul Zamecnik等人证实细胞中蛋白质合成的场所。他们把放射性标记的氨基酸注射到大鼠体内，经过一段时间后收获其肝脏，进行蔗糖梯度沉淀并分析各种细胞成份中的放射性蛋白质。如果注射后经数小时（或数天）收获肝脏，所有细胞成份中都带有放射性标记的蛋白质; 如果注射后几分钟内即收获肝脏，那么，放射性标记只存在于含有核糖体颗粒的细胞质成份中。（2）Francis Crick等人第一次证实只有用三联子密码的形式才能把包含在由AUGC四个字母组成遗传信息（核酸）准确无误地翻译成由20种不同氨基酸组成的蛋白质序列，实现遗传信息的表达。实验1: 用吖啶类试剂（诱导核苷酸插入或丢失）处理T4噬菌体rII位点上的两个基因，使之发生移码突变（frame-shift），就生成完全不同的、没有功能的蛋白质。实验2: 研究烟草坏死卫星病毒发现，其外壳蛋白亚基由400个氨基酸组成，相应的RNA片段长1200个核苷酸，与密码三联子体系正好相吻合。实验3: 以均聚物为模板指导多肽的合成。在含有tRNA、核糖体、AA-tRNA合成酶及其它蛋白质因子的细胞抽提物中加入mRNA或人工合成的均聚物作为模板以及ATP、GTP、氨基酸等成分时又能合成新的肽链，新生肽链的氨基酸顺序由外加的模板来决定。 1961年，Nirenberg等以poly（U）作模板时发现合成了多聚苯丙氨酸，从而推出UUU代表苯丙氨酸（Phe）。以poly（C）及poly（A）做模板分别得到多聚脯氨酸和多聚赖氨酸。实验4: 以特定序列的共聚物为模板指导多肽的合成。以多聚二核苷酸作模板可合成由2个氨基酸组成的多肽， 5'…UGU GUG UGU GUG UGU GUG…3',不管读码从U开始还是从G开始，都只能有UGU（Cys）及GUG（Val）两种密码子。实验5: 以共聚三核苷酸作为模板可得到有3种氨基酸组成的多肽。如以多聚（UUC）为模板，可能有3种起读方式： 5’…UUC UUC UUC UUC UUC…3’或 5’…UCU UCU UCU UCU UCU…3’或 5'…CUU CUU CUU CUU CUU…3'分别产生UUC（Phe）、UCU（Ser）或CUU（Leu）. 多聚三核苷酸为模板时也可能只合成2种多肽：5’…GUA GUA GUA GUA GUA…3’或5’…UAG UAG UAG UAG UAG…3’ 或5’…AGU AGU AGU AGU AGU…3’由第二种读码方式产生的密码子UAG是终止密码，不编码任何氨基酸，因此，只产生GUA（Val）或AGU（Ser）。实验6: 以随机多聚物指导多肽合成。Nirenberg等及Ochoa等又用各种随机的多聚物作模板合成多肽。例如，以只含A、C的多聚核苷酸作模板，任意排列时可出现8种三联子，即CCC、CCA、CAC、ACC、CAA、ACA、AAC、AAA，获得由Asn、His、Pro、Gln、Thr、Lys等6种氨基酸组成的多肽。（3）氨基酸的“活化”与核糖体结合技术。如果把氨基酸与ATP和肝脏细胞质共培养，氨基酸就会被固定在某些热稳定且可溶性RNA分子（transfer RNA，tRNA）上。现将氨基酸活化后的产物称为氨基酰-tRNA（aminoacyl-tRNA），并把催化该过程的酶称为氨基酰合成酶（aminoacyl-tRNA Synthetase）。以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、UGU等为模板，在含核糖体、AA-tRNA的反应液中保温后通过硝酸纤维素滤膜，只有游离的AA-tRNA因相对分子质量小而通过滤膜，而核糖体或与核糖体结合的AA-tRNA则留在滤膜上，这样可把已结合与未结合的AA-tRNA分开。当体系中带有多聚核苷酸模板时，从大肠杆菌中提取的核糖体经常与特异性氨基酰-tRNA相结合。如果把核糖体与poly（U）和Phe-tRNAPhe共温育，核糖体就能同时与poly（U）和Phe-tRNAPhe相结合。 4种核苷酸组成61个编码氨基酸的密码子和3个终止密码子，它们不能与tRNA的反密码子配对，但能被终止因子或释放因子识别，终止肽链的合成。由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并（degeneracy），对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子（synonymous codon）。三．密码子和反密码子的相互作用蛋白质生物合成过程中，tRNA的反密码子通过碱基的反向配对与mRNA的密码子相互作用。1966年，Crick根据立体化学原理提出摆动假说（wobble hypothesis），解释了反密码子中某些稀有成分如I以及许多有2个以上同源密码子的配对问题。 Wobble hypothesis ① 任意一个密码子的前两位碱基都与tRNA anticodon中的相应碱基形成Watson-Crick碱基配对。 ② 反密码子第一位是A或C时，只能识别一个密码子。当反密码子第一位是U或G时，能识别两个密码子。当Inosine（I）作为反密码子第一位时，能识别三个密码子。 (责任编辑：泉水)

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