cDNA文库构建策略及其分析研究进展(3)

2.2  差减  cDNA  文库  (Subtractive  cDNA  library)

　　差减文库也称扣除文库，使用两种遗传背景相同或大致相同但在个别功能或特性上不同的材料(如不同基因处理细胞系或植物的近等基因系等)提取  mRNA  (或反转录后合成  cDNA)，在一定条件下用大大过量不含目的基因的一方作为驱动子(  Driver  )与含有目的基因的试验方(  Tester  )进行杂交，选择性的祛除两部分共同基因杂交形成的复合物，往往进行多次的杂交—祛除过程，最后将含有相关目的基因的未杂交部分收集后，并连接到载体形成文库。消减杂交是构建差减  cDNA  文库的核心，差减文库是否构建成功很大程度上决定于差减杂交的效率。差减杂交的方法主要有(1)羟基磷灰石柱层析法  (HAP)；(2)生物素标记、链亲和蛋白结合排除法；(3)限制性内切酶技术相结合的差减方法；(4)差减抑制杂交法  (SSH)；(5)磁珠介导的差减法  (MAST)，其中  SSH  法最为常用。

　　抑制性消减杂交技术  (Suppression  Subtractive  Hybridization，SSH)  是  DIATCHENKO  等人于1996年依据消减杂交和抑制  PCR  发展出来的一种分离差异表达基因的新方法，主要用于分离两种细胞或两种组织的细胞中的差异表达基因。它主要是利用抑制  PCR  对差减杂交后丰度一致的目的材料中两端连有不同接头的差异表达片段进行指数扩增，而两端连接上同一接头的同源双链片段仅呈线形扩增，从而达到富集差异表达基因的目的。因此应用该技术能够对两个有差异表达的材料(细胞或组织)高、中、低丰度目的基因都进行有效、快速、简便克隆。近年来已成功应用于植物发育、肿瘤与疾病、以及外界因子诱导组织细胞中相关的应答基因的分析和克隆。

2.3  固相  cDNA  文库构建

　　cDNA  的固相合成是人们早为熟知的技术，但局限之处  oligo(dT)  与纤维素胶粒或磁珠的结合比较牢固，将  cDNA  洗脱下来时得率不是很高，而且以后的反应步骤也不能都在介质上进行，这可能是该技术应用并不十分广泛的原因。

　　最近  THOMAS  ROEDE  提出了一种新的  cDNA  文库固相合成方法(  THOMAS  ROEDE，1998)，克服了以前文库构建中存在的缺点，所用的酶和试剂与传统方法完全相同，不同的是  cDNA  的合成和修饰均在固相支持物—磁珠上完成。cDNA  通过一个生物素固定在链霉素偶联的磁珠上，这样在反应过程中就可以简便而迅速的实现酶和缓冲液的更换，因此它将快速与高质量的文库构建结合在一起(构建文库只需1  d)，并且构建的文库适合大多数的研究目的。

　　固相  cDNA  合成法的主要优点是可以简便  cDNA  合成的操作。在进行缓冲液更换时既没有  cDNA  的丢失之忧，也无其它物质污染之忧。另外，用此方法可以得到真实的代表性文库，它包含有短小的  cDNA，这是因为在克隆之前省去了分级分离的步骤。总之，固相法结合了传统的  cDNA  合成的优点并弥补了其不足。这种方法简便易行，可靠低廉，所建文库高质量，因此它可能会替代目前应用的  cDNA  文库操作方法。

　　另外，最近发展起来的微量  RNA  的  cDNA  构建，是使用  PCR  技术，在实验室条件下扩增的  mRNA  的  cDNA  量，其  PCR  检测的灵敏度远远大于反转录  PCR(RT-PCR)  法。微量  RNA  的  cDNA  PCR  文库的构建可为有关微量活性物质遗传基因的研究提供方便。

3  cDNA  文库应用于分离新基因的方法

　　发现并分离克隆新基因始终是分子生物学研究的主要任务和目的，虽然  cDNA  文库的用途很多，但是，应用于分离新基因是其最重要的用途。前述的不管是哪种类型的  cDNA  文库，都可以用于分离新基因，只是使用的方法有差异。分离方法主要有两种：第一，对于非全长  cDNA  文库，即不管是经典的  cDNA  文库方法或差减法构建的  cDNA  文库，需要利用已经获得的新  cDNA  序列片段，通过  RACE  方法获得新基因的全长序列。第二，利用全长  cDNA  文库与目的基因片段作为探针的杂交筛选。

3.1  从非全长  cDNA  文库中筛选新基因

3.1.1  RACE  法

　　RACE  文库即快速扩增  cDNA  末端法(  Rapid  Amplification  of  cDNA  End，RACE  )只需知道  mRNA  内很短的一段序列即可扩增出其  cDNA  的5'(5'  RACE  )和3'端(3'  RACE  )。该法的主要特是利用一条根据已知序列设计的特异性引物和一条与  mRNA  的  PolyA  (3'  RACE  )或加至第一链  cDNA  3'端的同聚尾(5'  RACE  )互补的通用引物，由于同聚体并非良好的  PCR  引物，同时为了便于  RACE  产物的克隆，可向同聚体引物的5'端内加入一内切酶位点。所用的  cDNA  模板可以使用多聚  dT  引物延伸合成(3'，5'-RACE  均可)。当  RACE  PCR  产物为复杂的混合物时，可取部分产物作模板，用另一条位于原引物内侧的序列作为引物与通用引物配对进行另一轮  PCR  (巢式  PCR  )。早在1988年，FROHMAN  等即用此方法成功地获得了4种  mRNA  的5'合3'末端序列。   (责任编辑：泉水)

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