cDNA文库构建策略及其分析研究进展(4)

　　迄今已有几种改良的  RACE  方法，通过修饰与优化，与最初的  FROHMAN  报道有所不同：(1)  BARSON  等采用锁定寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸引物“锁定”基因特异性序列的3'末端与其  Poly  (A)  尾的连接处，进行第1条  cDNA  链的合成，消除了在合成第1条  cDNA  链时寡聚  (dT)  RNA  模板  Poly  (A)  尾任何部位结合而带来的影响。(2)  EDWARDS  和  TROUTT  小组利用  T4  RNA  连接酶把寡核苷酸连接到单链  cDNA  的5'末端，然后用一个3'末端特异性引物和一个锚定引物就可以直接对锚定连接的  cDNA  进行体外  PCR  扩增和克隆。随后，BERTLING  等又用  DNA  连接酶代替  RNA  连接酶。这些方法都避免了在第2条  cDNA  链内同聚序列区互补而导致截断  cDNA  的产生。(3)  MARUYAMA  等提出  cRACE  法，采用的引物为基因特异性的，所以非特异性  PCR  产物基本上不会产生。Clontech  等公司也根据  RACE  法的更新，相继推出了  RACE  的相应试剂盒，为克隆  cDNA  提供了方便的工具。最近  HUANG  等人即用  RACE  试剂盒克隆了一种含有类植物血凝素免疫受体  ITIM。

3.1.2  用  PCR  法从  cDNA  文库中快速克隆基因

　　通过对文库的筛选或适用简并引物进行  PCR  反应，常常只能获得不完整的  cDNA  片段。为了得到  cDNA  全长，常常要重新筛选文库。重新筛选文库工作量大，RACE  虽然为此提供可方便，但应用该方法需重新提取  mRNA  和反转录。而用  PCR  法从  cDNA  文库中快速克隆基因的方法，只需提取  λ  噬菌体  DNA，按保守序列设计  PCR  引物便可将未知片段进行克隆。特别是在基因的两端变异较大而中间某区域保守的情况下，用  PCR  法很容易获取  cDNA  的全长。同一转录产物，又是存在着不同的拼接方式，通过筛库的办法同时将不同拼接方式的克隆筛选出来可能性较小，而使用  PCR  扩增后，有利于观察到不同的拼接方式。另外，为研究基因在不同组织中表达情况，常根据差异显示法找出特异的  mRNA。

3.2  从全长  cDNA  文库中进行杂交筛选

3.2.1  标记探针  cDNA  文库筛选法

　　cDNA  文库通常涂抹到母盘培养基上，然后再把这些菌落的样品吸印到硝酸纤维素膜或尼龙膜上；这时加入标记的探针，如果出现杂交信号，那么从母盘上就可以把包含杂交信号的菌落分离、培养出来。以此筛选出阳性克隆，进行序列分析，以获得  cDNA  全长。该方法能避免  PCR  扩增的非特异性扩增或错配，是一种比较准确可靠的  cDNA  克隆方法。主要缺点是克隆过程需要一系列的酶促反应、产率低、费时长、工作量大。该方法适合于表达丰度高的基因的筛选分离。用于做标记探针的  DNA  片段可以是其它生物的基因片段，在这种情况下筛选出来的基因往往是已分离基因的同源基因；如果用于做标记探针的  DNA  片段是通过新分离蛋白质的氨基酸反推设计的  DNA  序列，或者是特异分子标记子  DNA  序列，那么可以筛选得到新功能基因。

3.2.2  反式  PCR

　　反式  PCR  克隆  cDNA  全长的基因原理是：双链  cDNA  合成后进行尾—尾连接，环化的  cDNA  用位于已知序列内的限制性内切酶酶切位点造成缺口或用  NaOH  处理使之变性，然后用2条基因特异性引物对重新线性化或变性的  cDNA  进行扩增。反式  PCR  的优势在于，它采用了2条基因特异性引物，因此不易产生非特异性扩增。该方法可以快速、高效地扩增  cDNA  或基因组中已知序列两侧位置的片段。

4  小结

　　随着生物及信息技术的迅速发展，寻找新基因、克隆新基因、进而研究基因的功能已成为功能基因组研究中的一项重要工作。在过去寻找新基因的方法中，以消减杂交、mRNA  差异显示，cDNA  的代表性差异显示分析法、差异消减展示等方法应用最广。这些方法在新基因的发现方面都各有其独特的优势，可寻找出一些差异表达序列，但这些差异表达序列大部分情况都是不完整的基因。目前，比较可行而且应用较多的方法主要还是  cDNA  文库的筛选。一方面  cDNA  文库只代表一定时期一定条件下正在表达的基因，是整个真核基因组中的少部分序列，因此  cDNA  克隆的复杂程度比直接从基因组克隆的要小得多；另一方面由于每个  cDNA  克隆只代表一种  mRNA  序列，因此在基因克隆过程中出现假阳性的概率比较低，所以  cDNA  文库的构建已成为当前分子生物学研究和基因工程操作的基础。本文涉及到的有关  cDNA  文库构建方法，是目前比较常用的，这些方法各有优缺点，研究者应根据自己的实际情况，选择合适的技术，已达到自己预期的目的。 (责任编辑：泉水)

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