蛋白的Western blot 检测标准操作规程
时间:2012-07-27 12:28 来源:网络 作者:未知 点击:次
一、实验名称:蛋白的Western blot检测 二、实验目的:蛋白质的检测与分析 三、背景知识:Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。可以非常有效的鉴定某一蛋白质(或表位)的性质;结合免疫沉淀法,可以用来定量分析小分子抗原。2. 表位作图3. 结构域分析 4. 斑点印迹,可用层析组分,蔗糖梯度或脉冲追踪实验分析5. 功能实验中蛋白质复性6. 配基结合,免疫印迹后多种配基可同蛋白质进行配基结合试验。7. 抗体纯化8. 有膜上收获蛋白质条带制备抗体9. 氨基酸组成分析和序列分析,极微量蛋白质(10pmol)转移到PVDF膜上或可进行氨基酸组成分析和序列分析。转移的蛋白质或多肽条带可经考马斯亮蓝染色后切下进行氨基酸组成分析或序列分析。 四、基本原理:与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 五、药品和试剂:检测试剂盒包括1)30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺;2)4×Tris•Cl/SDS; 3)4×Tris•Cl/SDS, pH6.8;4)4×SDS电泳缓冲液;5)TEMED; 6)10%过硫酸铵;2.抗体试剂盒 六、仪器设备与材料:快速筛选型电泳系统(美国伯乐公司),包括:mini-protean4,PowerPac HC高电流电泳仪,SD 半干转印槽 七、实验对象:人动物组织、细胞 八、实验环境:室温
九、操作步骤:1)按厂商的使用指南用两块干净的玻璃,平板和0.75mm垫片组装电泳装置中的玻璃平板夹层,并固定在灌胶支架上。
15)关闭电源并撤去连接的导线,弃去电泳缓冲液。连同上槽一起将凝胶夹层取出。
17)小心将封边的垫片抽出一半,并以此为杠杆橇起上面的玻璃平板,使凝胶暴露出来。
20)清洗:将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次,每次5分钟。摇床摇动。
23)清洗:将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次,每次5分钟。 十、实验结果评价:化学发光法检测,膜与化学发光底物孵育,经X胶片曝光显影。图片扫描保存为电脑文件,并用GIS1000分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。数据分析:目的蛋白的灰度值除以内参GAPDF的灰度值 以校正误差,所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。 十一、注意事项:丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收,其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为它还可能含有少量未聚合材料,由于过硫酸铵会缓慢分解,故应隔周新鲜配制。
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