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今天分享一篇2022年发表在《德国应用化学》(Angew. Chem. Int. Ed.)上的文章。该文的第一位通讯作者是维尔茨堡大学的Hans M. Maric教授，主要从事开发并应用高端生物物理装置来研究蛋白质-蛋白质相互作用。第二位通讯作者是法国国家卫生研究院的Christian G. Specht研究员，研究方向是使用定量和动态单分子成像策略探索轴突和突触中分子相互作用的调节。

突触是指一个神经元的冲动传到另一个神经元或传到另一细胞间的相互接触的结构，主要由突触前膜、突触间隙和突触后膜三部分组成。根据释放神经递质的不同，突触可分为兴奋性突触和抑制性突触。抑制性突触又可分为甘氨酸能突触和γ-氨基丁酸（GABA）能突触。对突触进行标记以实现可视化研究，对基础神经科学和临床应用具有重要意义。

目前，抑制性突触的识别主要通过几种标志性蛋白实现，例如囊泡GABA转运体、GABA能突触的GABA受体γ2亚单位，或甘氨酸能突触的甘氨酸受体α1亚单位。最常见的抑制型突触标志物是突触后膜上的支架蛋白——桥蛋白。桥蛋白存在于甘氨酸能突触和GABA能突触的突触后膜，起到固定突触受体的作用。识别与标记桥蛋白即可实现抑制性突触的识别与可视化。

目前桥蛋白的标记方式主要有两种：一种是基因标签法，即将发光蛋白与桥蛋白融合，通过观察发光蛋白确定桥蛋白状态。这种方法可用于活细胞和固定细胞的突触研究，也可应用于转基因动物，但融合蛋白可能影响桥蛋白的形态和功能，且转基因模型有限，限制了其发展。另一种是免疫染色法，利用抗原抗体相互作用标记目标蛋白，但该方法不能用于活体，抗体大小和交联趋势影响标记性能，对组织和复杂样本不友好。作为替代和补充，亲和力探针具有尺寸小、组织渗透性好、可结合特定异构体或活性状态的优点。基于此，作者设计了一种亲和力探针Sylite，作为多功能工具可视化不同尺度上的神经元结构。

图1 （A）TMR2i、SyliteM和Sylite的化学结构。（B）Sylite与桥蛋白E结构域结合的模型。（C）表达eGFP-桥蛋白和单独表达eGFP的COS-7细胞的荧光图。（D）TMR2i、SyliteM和Sylite的信噪比对比图。

设计策略：甘氨酸受体β亚基上的一段多肽是与桥蛋白亲和力最高的天然氨基酸序列。在之前工作中，作者对这段序列进行筛选，得到了具有更大亲和力的探针TMR2i。在此工作中，作者在TMR2i基础上改造，得到二聚体探针Sylite及其单体形式SyliteM（结构如图1A）。由于桥蛋白具有二聚性，二聚形式的Sylite可一次性与两个桥蛋白结合。作者模拟了Sylite与桥蛋白的结合方式（图1B），并评估了其可视化效果。将表达融合绿色荧光蛋白的桥蛋白的细胞固定并用Sylite染色，结果显示Sylite能清晰显示桥蛋白分布（图1C）。三种探针的信噪比比较表明，Sylite具有超高信噪比（图1D）。

图2 （A）ITC法测定桥蛋白E结构域滴定Sylite和SyliteM的热信号。（B）LC-MS/MS分析Sylite和SyliteM特异性。

作者使用等温滴定微量热法（ITC）测定Sylite对桥蛋白的亲和力。解离常数KD指引起最大效应一半（50%受体被占位）时的药物浓度。如图2A，Sylite对纯化桥蛋白E结构域的KD值为17.5 nM，比单体SyliteM的亲和力增加11倍，表明探针具有很高的亲和力。此外，化学计量比为1:2，验证其二聚体设计。利用LC-MS/MS研究探针特异性，分析全脑蛋白质组的Sylite相互作用组，如图2B，桥蛋白具有最多的特异性多肽片段，说明Sylite对桥蛋白具有很好的特异性。

图3 （A）桥蛋白锚定突触后膜上的甘氨酸受体GlyRs和GABA受体GABAARs。（B）用Sylite和桥蛋白抗体标记的桥蛋白异构体的图像。（C）探针与不同桥蛋白异构体相互作用的区域。

随后，作者表征了探针靶向具有功能活性的桥蛋白异构体的性质。桥蛋白有多种异构体，有的负责神经元传导，有的则无关。与针对不一定独特的蛋白质片段产生的抗体不同，Sylite被设计为功能探针，只与发挥功能作用的异构体结合。如图3a，桥蛋白主要由C区、G区、E区组成，E区对GlyR β亚基具有高亲和力，即Sylite靶向区域。作者比较了HEK293细胞中11种桥蛋白异构体的结合图谱（图3B），图中空白格表示缺失，斜纹格表示交换。从图可知，Sylite只与E区结构完整的异构体结合。选取HEK293细胞中的桥蛋白异构体14进行成像，mAb3B11可在转基因细胞中染色但不能分辨细小斑点，而Sylite不仅标记重组桥蛋白，还能清楚显示细小斑点，表明Sylite非常适合于检测活性突触和量化功能相关的受体结合位点。mAb7a未能成功标记桥蛋白，原因是桥蛋白异构体14发生了磷酸化，而mAb7a标记依赖于C区的一个磷酸化表位。

图4 （A）用Sylite或SyliteCy3固定染色的原代野生型海马神经元的荧光图。（B）Sylite或SyliteCy3的皮尔逊共定位系数。（C）与感染神经元内参考信号mEos2-桥蛋白相比，mAb7a或Sylite标记突触的强度依赖图。（D）标记神经元突触前膜的RIM和突触后膜的桥蛋白示意图。（E）双色dSTORM可视化单个突触的平面投影和正面视图。（F）mAb3B11、mAb7a和Sylite分别测得RIM与桥蛋白之间的距离。

在荧光显微镜中，多光谱通道同时成像常为评估生物学问题所必需。作者将Sylite原有结构上的Cy5荧光团换成Cy3，扩大其光谱范围。将两种探针应用于初级神经元，如图4A，Sylite和SyliteCy3均显示神经元胞体中的抑制性突触和弥漫的桥蛋白，共定位系数很高（图4B）。作者用Sylite和mAb7a对表达桥蛋白荧光融合蛋白的皮质神经元染色，发现Sylite与荧光信号（即桥蛋白）存在线性且更密切的相关性（图4C）。

作者还验证了Sylite用于纳米测量的能力。研究表明，突触前活动区蛋白RIM与桥蛋白形成跨突触纳米柱。RIM是突触前定位蛋白，介导囊泡释放并参与调控可塑性。RIM与桥蛋白在突触前后膜对齐，保证信号快速有效传递。为测定RIM与桥蛋白的距离，作者在皮质神经元中分别标记二者，使用直接随机光学重建显微镜（dSTORM）成像（图4D）。图4E为检测到的单个突触的平面投影和正面视图，桥蛋白与RIM分布非常匹配，平均距离为129±24 nm，与文献一致。与mAb7a和mAb3B11相比，Sylite提供了更精确的读数（图4F）。

图5 （A）海马背侧切片DAPI（蓝色）和Sylite（绿色）染色的宏观图像。（B）海马体腹侧切片上Sylite染色的3D共聚焦图像。（C）细胞核和抑制性突触的三维体积表示。使用mAb3B11和Sylite共同标记了24小时的桥蛋白的截面侧视图。（D）染色24小时后，50 μm厚的小鼠海马区切片中沿Z轴（深度）的Sylite和抗体标记的分布图。

作者发现Sylite具有优秀的组织穿透能力。传统的抑制性突触组织染色复杂耗时，通常仅限于≤16 μm的薄脑切片，而Sylite可有效穿透50 μm厚的组织切片，仅一小时即可实现高对比度标记。先使用20倍荧光显微镜宏观观察海马区抑制性突触分布（图5A），然后重建3D图像（图5B）。图5C为使用mAb3B11和Sylite共同标记24小时后的切片侧视图，灰色代表共同标记的桥蛋白，可见mAb3B11仅标记切片上下两端，切片中间仅有Sylite染色的桥蛋白。图5D更直观显示，Sylite能对50 μm厚的切片进行均匀染色，而mAb3B11和mAb7a的染色呈现三明治形状。

图6 （A）两组转基因小鼠的示意图。（B）中脑导水管周围灰质注射和表达定位的解剖示踪方案。（C）脑切片的单个dmPAG GABA能神经元胞体的三维重建。（D）在PAG dm区中，甘氨酸能突触靶向的桥蛋白簇平均比无甘氨酸能突触靶向的桥蛋白簇大。（E）在PAG dm区中，甘氨酸能突触投射对GABA能突触和谷氨酸突触中桥蛋白密度分布的影响。左：有甘氨酸能突触投射的GABA能突触和谷氨酸突触中的桥蛋白密度分布；中：没有甘氨酸能突触投射的GABA能突触和谷氨酸突触中的桥蛋白密度分布；右：dm区全部GABA能突触和全部谷氨酸能突触中的桥蛋白密度分布。

导水管周围灰质（PAG）是中脑区域，在协调防御反应中起重要作用，但其精确回路机制和神经解剖学基础仍有待阐明。PAG分为多个区，如图6B所示。作者使用细胞型特异性病毒介导的突触素免疫标记，识别突触前末梢的甘氨酸。观察到这些神经元从PAG的vl区局部投射到PAG的dm区。为识别PAG vl区甘氨酸能神经元的目标输出细胞并表征抑制性突触后膜，作者选用两组小鼠，通过病毒介导PAG dm区荧光蛋白表达分别标记谷氨酸能神经元或GABA能神经元，并使用Sylite识别突触后膜位置。图C为3D重建的单个PAG dm区GABA能神经元细胞体（淡蓝色，透明），其中发现多个桥蛋白簇（绿色）。

作者评估了Sylite所显示的突触后致密区大小，发现被PAG vl区甘氨酸能突触靶向的桥蛋白簇比非甘氨酸能突触靶向输入的簇更大（图6D）。随后研究甘氨酸能突触投射情况，确定在dm区谷氨酸能神经元和GABA能神经元周围存在甘氨酸能突触前膜，表明PAG vl区甘氨酸能神经元可能在两个功能不同的dm区神经元中发挥抑制作用。有甘氨酸能神经元投射的GABA能和谷氨酸能神经元中的桥蛋白密度几乎相同，但没有甘氨酸能神经元投射的GABA能神经元具有比谷氨酸能神经元更高的桥蛋白密度，dm区GABA能神经元的桥蛋白密度更高，说明GABA能神经元接受了更强的抑制性输入（图6E）。

综上所述，通过对结合序列的系统改进、荧光染料的裁剪和二聚作用，该文设计了一个具有高度选择性和亲和力的抑制性突触探针Sylite。与传统亲和探针相比，其优势包括：具有线性读出的功能抑制突触选择性标记、快速直接的组织染色以及与超分辨率显微镜的兼容性。与先进成像技术结合，合成探针如Sylite开辟了神经科学研究新途径，可实现多重研究、更好的定位精度、分辨率和组织染色。未来，Sylite衍生物也可能与新的细胞穿透技术协同使用，促进活细胞成像和功能靶向，在体内应用和药理学研究。

作者：蘧文雅

核稿者：张馨、刘丽

上传者：刘继红

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ange.202202078

原文引用：DOI: https://doi.org/10.1002/ange.202202078