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一种简单的热带爪蟾胚胎收集方法

作者：Vladimir S. Apekin / Sive实验室

引言

热带爪蟾（Xenopus tropicalis）体型较小，使得传统的非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎收集方法难以适用。因此，我们基于热带爪蟾在产卵过程中的行为特点，开发了一种新的胚胎收集方法。

在人工环境中，热带爪蟾的产卵分为两个阶段：

1) 第一阶段为平静期。在最后一次注射激素后1.5-2小时开始，持续15-60分钟。行为与非洲爪蟾非常相似：雄蟾抓住雌蟾，成对游动并散布胚胎，期间会间歇性休息。

2) 第一阶段逐渐过渡到第二阶段——兴奋期。其特征是蟾蜍周期性出现狂乱快速的动作，并翻转至背部朝上（图7和图8）。雄蟾会紧紧抱住雌蟾，因此可以轻松地将这对蟾蜍短时间转移到另一个容器中。大多数情况下，这不会中断产卵过程。

产卵的强度和连续性取决于蟾蜍的健康状况和注射的激素量。

胚胎收集方法

A. 注射激素

1) 用蒸馏水稀释绒毛膜促性腺激素，使终浓度为1500 IU/ml。用1 ml注射器吸取激素，配备26号针头。

2) 用手握住蟾蜍，使其背部朝向手掌，后腿置于食指之间（图1）。用食指和中指夹住右后腿，暂时固定蟾蜍（图2）。用拇指拨开左后腿，为注射腾出空间（图3）。注意不要过度拉伸腿部。

3) 将激素注射到背淋巴囊中（图4和图5）。确保针头仅刺入蟾蜍身体一半长度。雌蟾注射0.1 ml，雄蟾注射0.05 ml。注射后针头在体内停留一秒钟，以防止液体漏出。

整个过程必须快速完成，由于热带爪蟾体型小，需要练习。

B. 收集胚胎

1) 注射两只雌蟾和三只雄蟾，将它们放入一个大小合适的水族箱中，箱内装有蛙系统水（电导率=1.5±0.2西门子，温度=26±1°C），水深约2英寸。用带孔的盖子盖住水族箱。

2) 1.5-2小时后，雄蟾会抓住雌蟾，标志着产卵开始（图6）。此时将这对蟾蜍转移到另一个条件相同的水族箱中，再给它们15-60分钟，让过程强度增加。

3) 当蟾蜍开始规律地翻转时（图7），小心地将这对蟾蜍移入一个1升的玻璃或Nalgene烧杯中，烧杯内装有400 ml 0.1×MBS溶液（图8）。蟾蜍会在烧杯中产卵。大多数情况下，这对蟾蜍不会分开，会继续产卵；但如果雄蟾离开雌蟾，可能需要等待它们重新配对以继续产卵过程。

4) 上述方法可用于收集3-4批胚胎。如果蟾蜍产卵活跃，10-20分钟即可收集200-400个胚胎，通常足够一次实验使用。然后可以将这对蟾蜍转移到另一个玻璃烧杯中，收集更多胚胎，使每个烧杯中的胚胎大致处于同一发育阶段。一对蟾蜍在整个产卵过程中可产出多达3000-5000个胚胎。

需要注意的是，由于蟾蜍的运动，烧杯中的卵会聚集成团。胚胎应尽快转移到培养皿中，并去除卵团。这样可以确保每个胚胎获得等量的氧气，使其发育同步，并防止窒息。

讨论

方法的优点

• 受精和发育率高（80-90%）
• 操作简单
• 无需处死雄蟾

方法的缺点

• 产卵过程持续2-4小时，最佳收集时间仅限1-2小时
• 收集的卵样需立即处理，因为胚胎成团可能窒息

图1. 握住蟾蜍，使其背部贴住手掌，食指置于两腿之间。

图2. 用食指和中指夹住右腿。

图3. 用拇指拨开左腿。

图4. 注射区域。

图5. 注射激素。

图6. 蟾蜍成对抱合。

图7. 成对蟾蜍翻转至背部朝上。

图8. 在烧杯中产卵。

如果您对此方法或Sive实验室的蟾蜍饲养有任何疑问，请发送邮件至Vladimir Apekin：apekin@wi.mit.edu。