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描述

本实验方案旨在可视化曾位于质膜上的内化受体及其在生物合成途径中的受体。该方案特别适用于可视化激动剂诱导的受体内化过程。

实验步骤

细胞培养

将细胞接种到18毫米见方的盖玻片上。用聚赖氨酸预处理盖玻片有助于细胞附着。注意不要让细胞过于融合，否则在洗涤过程中整片细胞会从盖玻片上脱落。

1. 使用6孔细胞培养板，每孔加入2毫升培养基。

2. 在培养箱中平衡培养基（约30-45分钟）。

3. 加入盖玻片。再次在培养箱中平衡（约25分钟）。注意：最好执行这两个平衡步骤，但并非必要。

4. 用激动剂处理细胞（通常为5-25分钟）。

5. 快速吸去培养基，加入固定液（约2毫升/孔）。固定15-20分钟。

6. 洗涤3次。

7. 吸去最后一次洗涤液，注意将盖玻片边缘擦干。仅在盖玻片上加入Blotto（约50微升），并孵育20分钟。注意：我们仅将Blotto直接涂在盖玻片上，以减少处理每个盖玻片所需的体积。变体：有些人将盖玻片转移到含有少量湿的Whatman纸的培养皿中的一张Parafilm上。Parafilm有助于抗体溶液在盖玻片上“聚集”，而湿的Whatman纸有助于防止抗体干燥。

8. 吸去Blotto，仅在盖玻片上加入一抗。孵育45分钟。用Blotto稀释抗体。以下是一些典型的稀释比例：单克隆M1小鼠抗Flag抗体（Sigma, Covance）（Ca²⁺敏感）1:350-1:500；多克隆12CA5小鼠抗HA（Roche）1:1000。

9. 洗涤3次。

10. 进行第二次Blotto封闭，如上所述，5分钟。

11. 吸去Blotto，加入二抗。避光孵育20分钟。用Blotto稀释抗体。Cy3驴抗小鼠1:500，FITC山羊抗小鼠1:500，TexasRed山羊抗小鼠1:500。

12. 洗涤3次。

13. 使用抗褪色溶液（如VectaShield（Vector Labs）或Citifluor（Ted Pella））进行湿装。将少量封闭介质放在玻璃载玻片上。使用镊子拾起盖玻片，吸去多余液体。将盖玻片细胞面朝下放置在玻璃载玻片上。吸去盖玻片边缘的多余封闭介质。用指甲油密封边缘。

配方

洗涤液——总量2升；Maniatus TBS，含1mM CaCl₂，16克NaCl，6克Tris碱，0.4克KCl，0.294克CaCl₂·2H₂O，pH 7.4，用浓盐酸调节。

Blotto——总量10毫升，0.3克干牛奶（3%），100微升10% Triton X-100（0.1%），100微升100mM CaCl₂（1mM），500微升1M Tris-Cl，pH 7.5（50mM）。

固定液——每个盖玻片约2毫升，37%甲醛稀释1:10与PBS（150mM NaCl，10mM NaPi，pH 7.4）混合。

材料

（此处应列出所需材料）

提示

（此处应提供实验提示）