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描述

该协议允许使用荧光显微镜可视化稳定附着细胞系中表达的表位标签受体。与透过细胞的协议不同，本协议通过将抗体“喂”给活的未透过细胞，仅可视化最初位于细胞表面的受体。

步骤

1. 使用6孔组织培养板，每孔添加2mL培养基。

2. 在培养箱中平衡培养基（约30-45分钟）。

3. 添加盖玻片。在培养箱中平衡（约25分钟）。

4. 将初级抗体以1:500至1:1000的稀释度添加到培养基中，孵育30分钟。示例抗体：M1小鼠抗Flag抗体（Sigma, Covance）（Ca²⁺敏感）1:350-1:500；12CA5小鼠抗HA（Roche）1:1000多克隆抗体。

5. 处理细胞。典型的孵育时间约为25分钟。

6. 快速吸走培养基，添加固定液（约2 mL/孔）。固定15-20分钟。

7. 洗涤3次。

8. 吸走最后一次洗涤液，注意将盖玻片边缘擦干。仅在盖玻片上添加Blotto（约50μL），孵育20分钟。变体：有些人更喜欢将盖玻片转移到组织培养皿中的一张薄膜上，薄膜上放置少量湿的Whatman纸。薄膜有助于抗体溶液在盖玻片上“聚集”，湿的Whatman纸有助于防止抗体干燥。

9. 吸走Blotto，应用次级抗体。在黑暗中孵育20分钟。用Blotto稀释抗体。Cy3驴抗小鼠（Jackson Immunoresearch）1:500，FITC山羊抗小鼠1:500，TexasRed山羊抗小鼠1:500。

10. 洗涤3次。

11. 用抗褪色溶液湿装，即VectaShield（Vector Labs）或Citifluor（Ted Pella）。在玻璃载玻片上放置少量封装介质。使用镊子拾起盖玻片，吸走多余液体。将盖玻片细胞侧朝下放置在玻璃载玻片上。吸走盖玻片边缘的多余封装介质。用指甲油密封边缘。

配方

洗涤液——总量2升；Maniatus TBS，含1mM CaCl₂，16g NaCl，6g Tris碱，0.4g KCl，0.294g CaCl₂·2H₂O；pH 7.4，用浓盐酸调节。

Blotto——总量10mL，0.3g干奶粉（3%），100μL 10% Triton X-100（0.1%），100μL 100mM CaCl₂（1mM），500μL 1M Tris-Cl pH 7.5（50mM）。

固定液——每个盖玻片约2mL，37%甲醛稀释1:10与PBS（150mM NaCl，10mM NaPi，pH 7.4）混合。

材料

（此部分未提供具体内容）

提示

（此部分未提供具体内容）