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背景介绍

肿瘤坏死因子α（TNF-α）是一种重要的细胞因子，广泛参与细胞凋亡、炎症反应及免疫调节。L929细胞系是小鼠成纤维细胞，常用于评估TNF-α的细胞毒性作用。本实验通过MTT法检测TNF-α诱导的L929细胞死亡，为研究细胞凋亡机制及相关药物筛选提供基础。

实验材料与仪器

L929小鼠成纤维细胞（ATCC Cat. No. CCL-1）
培养基：RPMI，补充10%胎牛血清（FBS）
实验用培养基：RPMI，补充2% FBS
96孔平底培养板（Costar Cat. No. 3595）
放线菌素D，500 μg/ml储备液，-80℃保存，避光
MTT溶液（Sigma Cat. No. M5655），5 mg/ml，PBS溶解，室温避光保存
MTT裂解液：20% SDS/50% DMF
移液器及相关耗材
恒温湿润培养箱
96孔微板分光光度计

实验步骤

1. 按3.5×10⁵个/ml的密度制备L929细胞悬液，用实验培养基稀释。每孔加入100 μl，置于96孔板中，37℃、5% CO₂湿润培养箱中孵育过夜。
2. 按2倍梯度稀释样品和标准品（具体标准范围见快速指南），每孔100 μl，另置于96孔板的第2至12行，第1行为空白对照。
3. 将放线菌素D储备液按1:125稀释至4 μg/ml，避光操作。每孔加入50 μl工作液。
4. 将稀释后的样品和标准品各50 μl转移至相应的实验孔。
5. 37℃、5% CO₂条件下孵育24小时。
6. 每孔加入10 μl 5 mg/ml MTT溶液，继续孵育4小时。
7. 每孔加入50 μl MTT裂解液，过夜孵育。
8. 用分光光度计在570-650 nm读取吸光度，绘制标准曲线并分析数据。

实验意义

该方法可用于检测TNF-α诱导的细胞凋亡，广泛应用于细胞生物学、药物筛选及炎症机制研究。