生物行移动版

本文介绍了一种用于评估细胞培养单层中神经元存活率的荧光检测方法。

实验流程

大鼠胚胎皮层神经元单层培养，细胞密度为2-5 x 10⁵个/孔，使用预涂有聚-L-赖氨酸的24孔板（Becton-Dickinson Labware, Bedford, MA），在37°C、5% CO₂培养箱中培养2天，有或无测试药物存在。使用抗神经丝多克隆抗体（N-4142; Sigma, St. Louis, MO）免疫染色显示，约80-90%的细胞为神经元。

神经元存活率使用荧光存活染料calcein-AM（Molecular Probes, Eugene, OR）评估。简而言之，神经元培养物在指定时间点与测试药物共同作用后，单层细胞用1 ml磷酸缓冲盐水（PBS）洗涤一次，然后在37°C与1 μM calcein-AM的PBS溶液共同作用20分钟。细胞单层再用1 ml PBS洗涤两次，剩余的细胞荧光用荧光板读取器（CytoFluor II, Persceptive Biosystems, MA）在激发波长485 nm和发射波长530 nm下测定。所得数据使用GraphPad Prism 3.0软件（GraphPad Software, Inc, San Diego, CA）分析。荧光显微镜检查的神经元培养物证实，calcein AM荧光准确反映了培养皿中存活神经元的数量。

配方

Calcein AM（Molecular Probes, OR）1 mM DMSO溶液。在细胞培养生长培养基中稀释至最终浓度1微摩尔。

用品

荧光板读取器；标准细胞培养设施、用品和试剂。

提示

进行时间进程和浓度反应曲线，以确定最佳检测条件。