本文详细介绍了从成年大鼠中分离和培养背根神经节（DRG）神经元的实验操作流程。 培养表面准备 若使用盖玻片或细胞培养皿，需用大鼠尾胶原均匀涂布培养表面，干燥后可保存于细胞培养罩中过夜或在37°C下保存至多7天。 背根神经节（DRG）分离 1. 处死实验动物。
2. 取出脊柱，无需在生物安全柜中操作。
3. 在生物安全柜中，打开脊柱背侧，暴露脊髓。
4. 在脊柱顶部两侧各切一刀，去除约1mm宽的骨条，确保可见DRG。
5. 可使用解剖显微镜检查去除骨量的多少。
6. 去除脊髓（可选）。在脊柱底部两侧可见DRG。
7. 使用解剖显微镜，用微型镊子夹取DRG，放入2.5%胶原酶中。 DRG培养 1. 37°C下用2.5%胶原酶处理DRG 20分钟。
2. 加入小牛血清，1000 RPM离心5分钟，去除上清液。
3. 37°C下用0.5%胰蛋白酶处理15分钟。
4. 再次加入小牛血清，1000 RPM离心5分钟，去除上清液。
5. 用培养基重悬细胞，使用两支小牛血清涂布的玻璃移液管（约15次）进行吹打：全直径及火焰缩窄直径。
6. 通过细胞滤网将细胞转移到50ml离心管中。
7. 用培养基重悬细胞，接种到胶原涂布的盖玻片上（每孔约10滴），静置数小时待细胞贴壁后加入剩余培养基。 培养维护 每48小时更换一次培养基。在适当护理下，细胞可存活至多两周，健康培养可维持更长时间。 培养基配方 Neuralbasal-A培养基，含：
- 1x B-27（含抗氧化剂）
- 1x 青霉素-链霉素-新霉素
- 0.23 mM L-谷氨酰胺
- FUDR（可选，用于无施万细胞的培养）
- 10 ng/ml 神经生长因子（NGF，可选，成年大鼠培养无需添加） 实验材料 1. 实验动物：最佳选择12周龄雄性大鼠，年长动物细胞培养难度可能增加。
2. 手术工具：骨剪、镊子、微型剪刀、微型镊子等，确保所有工具灭菌。
3. 试剂：安乐死药物、大鼠尾胶原、小牛血清、胶原酶、胰蛋白酶、Neuralbasal-A培养基等。 (责任编辑：泉水) |