小鼠胚胎干细胞电穿孔转染实验方案

电穿孔是一种高效的将外源DNA导入哺乳动物细胞的方法，尤其适用于胚胎干细胞（ES细胞）。本方案基于BTX ElectroSquarePorator™ T820系统，针对小鼠ES细胞优化了参数，以实现高转染效率和细胞存活率。

细胞准备

生长培养基：DMEM + 10% 胎牛血清（HS）+ 非必需氨基酸 + β-巯基乙醇（B-ME）+ 白血病抑制因子（LiF）。

消化：使用0.5ml胰酶-EDTA（0.05%胰酶，0.02% EDTA）处理60mm培养皿中的细胞，37°C孵育5分钟。加入1ml培养基终止消化。

洗涤：离心收集细胞，弃上清，用HBS缓冲液重悬，重复洗涤一次。

细胞密度：调整至10⁷细胞/ml。

电穿孔设置

模式：低压（LV）

电压：500V

脉冲长度：99μs

脉冲次数：1次

电击杯：BTX一次性电击杯（P/N 620，2mm间隙）

场强：2.5 kV/cm

电穿孔步骤

样品体积：400μl

DNA浓度：40-80μg/ml

温度：室温

电击：按下Start按钮

孵育：电击后细胞在室温静置10分钟

铺板：用5ml培养基稀释细胞，接种于60mm培养皿中。

结果

阳性转染效率高，细胞存活率良好。

参考文献

个人通讯：Dr. Jonathon Dinsmore, Diacrin Inc., Charlestown, MA。

注：本方案由JIMMY XU提供。