自从DNA双螺旋结构被解析以来，科学家们在探讨健康与疾病的基因组复杂性与差异性方面付出了巨大的努力。然而，测序通量的限制和高昂的成本一直是深入分析基因组的主要障碍。2005年，高通量测序技术的推出初步解决了这一问题，人类基因组测序的成本迅速下降，催生了“下一代测序”（Next-Generation Sequencing, NGS）这一新名词。过去十多年间，NGS技术不断演进，人类基因组测序的成本已经降至1000美元/人。
一、NGS技术平台、发展趋势及临床应用现状
在国内，短读长NGS技术的临床应用主要基于边合成边测序（Sequencing-by-Synthesis, SBS）的Life平台和Illumina平台。Life Ion-Torrent平台采用单核糖核酸增加（Single-Nucleotide Addition, SNA）方法，而Illumina平台则依赖于循环可逆终止（Cyclic Reversible Termination, CRT）技术。尽管短读长NGS平台的总体准确率较高（>98%），但在读取高AT或高GC片段时的错误率仍不理想。由于基因组中存在重复序列、结构变异及拷贝数变化，短读长测序平台在解析这些信息时存在固有缺陷。近年来，基于单分子测序和合成法测序的第三代测序技术相继推出。PacBio Biosciences的单分子实时测序（SMRT）技术，其平均测序读长为10,000至15,000 bp。2014年，另一种基于纳米单分子测序技术的原型机MinION问世，平均测序读长超过10,000 bp。合成法长读长测序平台的发展主要有两个系统：Illumina长片段合成系统与10×Genomics乳液系统。第三代长读长测序平台的单个碱基错误率较高。
NGS技术已广泛应用于常规临床实践，涵盖无创产前检测（Noninvasive Prenatal Test, NIPT）、胚胎植入前遗传学诊断/筛查（Preimplantation Genetic Diagnosis/Preimplantation Genetic Screening, PGD/PGS）、遗传病、肿瘤及药物基因组等领域。2014年6月，国家食品药品监督管理总局批准了首个NGS诊断产品用于胎儿染色体非整倍体检测。NIPT是国内NGS应用最为成熟的领域。NGS在PGD/PGS中的应用优势在于能够利用单一平台实现单基因病和染色体异常的分析。2014年9月，我国诞生了世界首例应用多重退火成环循环扩增技术进行胚胎全基因组扩增NGS测序的试管婴儿。随着检测费用的降低和基因解读能力的提高，NGS在遗传病，尤其是罕见病的应用，已由基因组合向全外显子测序（Whole Exome Sequencing, WES）和全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS）转变。2010年，应用WES技术仅通过4个病例的WES便发现了米勒综合征的致病基因DHODH。2016年，一项前瞻性研究评估证实，单病例WES作为一线分子检测技术用于新生儿单基因疾病的临床效用性。另一项涉及54个国家1,000个家庭的研究表明，WGS对未确诊疾病的诊断率比经典遗传诊断方法更高。
目前，肿瘤NGS检测主要应用于遗传性肿瘤综合征筛查和体细胞突变分析。NGS使肿瘤防治措施得以前移至预防阶段。大量研究证实，某些遗传性肿瘤与关键基因突变相关。2017版美国国立综合癌症网络指南指出，可利用NGS检测相关基因突变并进行遗传咨询，例如与遗传性乳腺癌和卵巢癌、林奇综合征及神经纤维瘤等相关的高外显率基因突变。此外，NGS在体细胞突变分析领域应用最为广泛，通过NGS分析肿瘤起始、发展和转移阶段的遗传变异及相关驱动突变和伴随突变，有助于肿瘤患者的分类、预后、靶向治疗和耐药性分析。国际上相继成立多个测序计划，致力于破译癌症细胞的突变模式。癌症基因组计划已经发掘出近500万个肿瘤体细胞基因突变，并建立了全球最大、最广泛的癌症体细胞突变数据库。这些大量的前期工作为后续NGS的临床应用奠定了坚实基础。如今，临床利用肿瘤热点突变基因组合，可在1天内对几百个肿瘤相关基因的几千个热点突变位点进行快速检测。
肿瘤液体活检和单细胞测序是NGS应用的新方向。肿瘤患者的外周血中含有循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell, CTC）或游离肿瘤DNA（Circulating Tumor DNA, ctDNA）。CTC和ctDNA的取材便利，适用于肿瘤个体化诊断、预后和复发风险评估。2014年，一项针对非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC）患者的血浆ctDNA NGS检测发现，对Ⅱ～Ⅳ期NSCLC的检测敏感性高达100%。由于常规测序样品来源均为多细胞混合DNA，得到的序列信息是多细胞基因信息的平均值，或其中占优势数量细胞的DNA信息，而单个细胞的特性被忽视。单细胞NGS测序能够揭示细胞个体间的差异，为肿瘤分子分型和个体化治疗提供精细化指导，有助于准确理解肿瘤内部的异质性和肿瘤的演进。
越来越多的证据表明，在相关药物代谢通路中，编码药物代谢酶或相关蛋白基因的遗传变异决定了个体对药物的反应或药物敏感性。不同患者对同一药物的毒性和疗效反应各异。临床药物基因组学的发展日新月异。截至目前，美国食品药品管理局已公布了140余种药物，建议通过遗传信息指导其合理使用。美国临床遗传药理学应用委员会发布了35个药物的临床药物基因组学应用指南。目前，个体化用药主要针对某种药品开展一个或少数几个基因分型筛查，例如某些针对表皮生长因子受体靶向药的基因突变检测、铂类药物相关的敏感性基因检测，以及细胞色素P450家族基因如CYP2D6的分型检测等。影响药物代谢或敏感性的基因有很多，应用NGS技术可以获得单个患者成百上千个基因的分型结果，全面指导其用药。
二、NGS技术临床应用质控问题的现状和解决办法初探
NGS检测比常规分子检测复杂，实验操作和生物信息分析部分涉及众多实验处理和分析程序。从样本制备到数据分析，NGS过程中的每一步都可能引入错误，因此凸显了临床检测质控的重要性。2015年，国家卫生计生委临床检验中心对NGS检测体细胞突变有效性进行室间质评，结果显示64家参评实验室中仅有33家检测性能达到标准，只有17家实验室能够正确识别基因组合中的所有突变，这充分反映了NGS检测过程的复杂性以及制定统一检测规范的迫切性。目前，NGS缺乏统一的行业规范和检测标准，导致不同实验室和不同平台的检测结果无法进行比较。因此，需要对NGS实验操作部分和生物信息分析部分建立执行标准和质控监测事项，包括建立标准操作流程、验证流程、质量管理体系和数据可靠性验证等。生物信息分析部分应包括变异结果描述、附带结果报道、数据储存和版本可追溯性等。此外，标准品的应用应贯穿于NGS检测的整个流程。
三、NGS技术临床应用数据分析要点和报告内容及格式要求
NGS实验室对变异结果的描述及报告需遵循专业组织的建议与指导。建议遵循人类基因组变异协会的命名指南和美国医学遗传学与基因组学学会的遗传疾病变异分类指导。为避免结果混淆，在撰写临床结果报告时，需要详细列出每个变异位点对应的转录本版本号及蛋白编号。在描述疑似致病性变异时，需充分考虑疾病表型、不同人群的发病率、外显率及功能学实验，并充分利用一些公共数据库。对于一些外显子组或基因组检测来说，评估一个基因对疾病影响的程度，了解不同变异类型对疾病的贡献度及这些变异的遗传模式至关重要。报告内容和格式要求可参考中国医师协会检验医师分会发布的《临床基因检验诊断报告模式专家共识》、美国分子病理学会、美国临床肿瘤学会和美国病理学会的专家共识，以及欧盟NGS诊断指南。NGS检测报告的清晰性和一致性至关重要，应准确客观地描述所检验的结果，避免引起歧义。内容总体应明确简洁，并具有充分的解释。
四、我国NGS技术发展需要注意的几个问题
当前，国内NGS技术的硬件发展与国外同步，但软件建设相对滞后。硬件建设可以通过购买迅速完成，而软件建设则需要长时间的积累。软件建设包括适合国内国情的规范检测指南、合理有效的监管措施、完善的数据库系统以及符合患者需求的遗传咨询体系等。此外，为保证临床与检测实验室之间的沟通顺畅，需要积极提倡中文人类表型标准用语。随着基因测序技术的飞速发展，获取基因数据变得越来越便捷，但与之对应的表型信息采集效率却滞后。由于临床医学历史悠久，疾病的命名和分类复杂多样，许多疾病存在临床变异性，不同医师对患者的描述也存在差异。模糊的表型信息与基因数据的连接存在障碍，这给基因数据的解读带来了困难。
五、展望
随着NGS技术的不断改进，高通量长读长NGS将成为未来的发展趋势，检测对象将逐渐从DNA层面转向RNA层面。新一代NGS检测的灵敏度、准确性和操作便捷性将大幅提高。我们有理由相信，随着检测费用的持续下降、测序方法的优化升级、数据解读能力的智能化以及临床经验的不断积累，人员培训、数据处理、质量控制及伦理等问题都将迎刃而解，NGS技术将逐渐成为临床主要且常规的检测项目。
选自中华检验医学杂志, 2017, 40(07)