蛋白质的纯化是生物化学研究中的基础步骤，尤其是在大肠杆菌等原核表达系统中，表达的蛋白质可以以可溶性或包涵体的形式存在。随着蛋白质功能的不断被发现，纯化技术的不断改进极大地促进了蛋白功能研究和药物开发。蛋白质的物理化学性质多样，正是这些差异使得纯化成为可能，但也意味着每一种蛋白质都需要针对性的方法。近年来，利用T7噬菌体RNA聚合酶为基础的表达系统，使得高水平表达蛋白成为可能，表达水平可达细胞总蛋白的50%以上。
一、可溶性蛋白的纯化
（一）试剂准备
- T7·Tag亲和纯化试剂盒
- 缓冲液：4.29 mM 磷酸氢二钠（Na₂HPO₄），1.47 mM 磷酸二氢钾（KH₂PO₄），2.7 mM 氯化钾（KCl），3.137 mM 氯化钠（NaCl），1%吐温-20，pH7.3
- 洗脱缓冲液：0.1 M 柠檬酸，pH2.2
- 中和缓冲液：2 M Tris，pH10.4
- PEG 20000
（二）操作步骤
- 取100 ml含重组表达质粒的菌体，诱导表达后离心5000g，弃上清，悬浮于10 ml预冷的缓冲液中。用超声波破碎菌体，直至样品不再粘稠，随后在4°C离心14000g，取上清液过滤后备用。
- 将含T7·Tag抗体的琼脂糖充分悬浮，平衡至室温，装入层析柱中。用缓冲液平衡后，将样品液通过柱子，洗去未结合蛋白，用洗脱缓冲液洗脱目标蛋白，收集洗脱液后进行SDS-PAGE分析。
- 将洗脱的蛋白质用透析袋进行透析，去除多余的盐和缓冲液，最后用PEG 20000浓缩蛋白。
二、包涵体的纯化
包涵体是在高表达条件下，蛋白质未正确折叠形成的高密度不溶性颗粒。包涵体的形成受多种因素影响，包括表达速率、培养条件等。获得具有生物活性的蛋白质，必须将包涵体溶解并进行复性。包涵体中蛋白质含量高达40%至95%，但其非折叠状态不具生物活性。纯化步骤包括包涵体的提取、洗涤、溶解和复性，常用缓冲液包括含有脲素、盐酸胍等变性剂。
（一）试剂配制
- 缓冲液A：50 mM Tris-HCl（pH8.0），2 mM EDTA，100 mM NaCl
- 缓冲液B：50 mM Tris-HCl（pH8.0），1 mM EDTA，100 mM NaCl，1%NP-40
- 缓冲液Ⅰ：50 mM Tris-HCl（pH8.0），2 mM EDTA，100 mM NaCl，0.5% Triton X-100，4 M 尿素
- 缓冲液Ⅱ：50 mM Tris-HCl（pH8.0），2 mM EDTA，100 mM NaCl，3% Triton X-100
- 缓冲液Ⅲ：50 mM Tris-HCl（pH8.0），2 mM EDTA，100 mM NaCl，0.5% Triton X-100，2 M 盐酸胍
- 缓冲液C：8 M 尿素，10 mM β-巯基乙醇，100 mM Tris-HCl（pH8.0），2 mM EDTA，脱氧胆酸钠
（二）操作步骤
- 用缓冲液A漂洗菌体，离心收集菌体，重复此步骤以确保纯净。用超声破碎菌体，破碎率应超过95%，再离心收集包涵体沉淀。
- 用缓冲液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别超声洗涤包涵体沉淀，离心收集沉淀。用含高浓度脲素的缓冲液溶解包涵体，离心去除不溶物，获得溶解的蛋白溶液。最后，进行透析和稀释，准备进行重组蛋白的纯化。