描述

二元BAC（BIBAC）载体是一种适用于农杆菌介导的高分子量DNA植物转化的载体。BIBAC载体基于细菌人工染色体（BAC）文库载体，同时也是农杆菌介导植物转化的二元载体。该载体包含大肠杆菌F质粒的最小复制起始区和发根农杆菌Ri质粒的最小复制起始区，因此在大肠杆菌和根癌农杆菌中均以单拷贝质粒形式复制。BIBAC载体的T-DNA可转移至植物核基因组中。已发表的实例包括将30 kb的酵母基因组DNA片段和150 kb的人类基因组DNA片段插入BIBAC载体并转化至植物中。

操作步骤

1. 在含有适当抗生素的Luria肉汤中培养10 ml所需的大肠杆菌菌株，37°C振荡过夜。
2. 将10 ml培养物转移至含有适当抗生素的1升LB培养基中（2升锥形瓶），200-250 rpm振荡过夜。
3. 用500 ml离心瓶在8000 rpm离心10分钟收集细胞（使用Beckman JA10或等效转子，相当于11,300g）。倒掉上清液。将更多过夜培养物加入同一离心瓶再次离心，最终将1升培养物的细胞沉淀收集在一个500 ml离心瓶中。
4. 每升培养物用40 ml溶液I重悬细胞。对于单拷贝质粒：先加入10 ml溶液I重悬沉淀，再加入25 ml溶液I，然后加入含200 mg溶菌酶的5 ml溶液I，使溶菌酶终浓度为5 mg/ml。混匀后冰上孵育10分钟。
5. 每升培养物加入80 ml溶液II，轻轻混匀，冰上孵育10分钟。
6. 每升培养物加入40 ml预冷的溶液III，将离心瓶牢固但轻柔地颠倒几次混匀。会出现类似白软干酪的白色絮状物。冰上孵育15分钟。
7. 每升培养物加入10 ml ddH2O，轻轻混匀，8000 rpm离心20分钟。用纱布过滤上清液至250 ml量筒中，记录上清液体积，然后倒入干净的500 ml离心瓶中。
8. 向500 ml离心瓶中加入0.6倍上清液体积的2-丙醇，轻轻颠倒混匀，冰上孵育5分钟。8000 rpm离心10分钟。
9. 倒掉上清液，用巴斯德吸管吸除残留液体。通过向瓶内吹气或倒置真空干燥使沉淀部分干燥。
10. 以下步骤适用于VTi65.2转子（每管总容量5 ml）。每个沉淀最终用4 ml TE缓冲液重悬。先加入少量TE开始重悬，然后用巴斯德吸管逐滴加入2M Tris-base中和至pH 7.5-8.0（用pH试纸检测）。测量体积并调整至4 ml。
11. 对于4 ml体积，加入4.2 g氯化铯（后续再加入0.2 ml溴化乙锭）。待CsCl溶解后，加入0.2 ml储备液（10 mg/ml溴化乙锭）。
12. 在VTi65.2转子中，55,000 rpm、25°C离心过夜。
13. 用手持长波紫外灯（366 nm）照射梯度观察DNA。若可见两条带，下方条带为质粒DNA。有时单拷贝质粒制备中仅见一条带（高拷贝质粒若梯度过载也可能如此）。用18号针头和3 ml注射器抽取质粒条带。
14. 将DNA转移至新的超速离心管中，用CsCl/TE溶液（例如10 g CsCl溶于10 ml TE）加至管肩，可额外加入50 μl 10 mg/ml溴化乙锭。
15. 再次55,000 rpm离心至少6小时（通常过夜）。
16. 抽取下方质粒DNA条带至小玻璃管或Eppendorf管中。
17. 用TE饱和的正丁醇或TE/CsCl饱和的2-丙醇萃取溴化乙锭。
18. 在4°C下用TE缓冲液透析质粒DNA，多次更换缓冲液。

溶液配方

溶液I（4°C保存）：20%葡萄糖 22.5 ml，1.0 M Tris pH=8.0 12.5 ml，0.2 M EDTA pH=8.0 25.0 ml，ddH2O定容至500 ml。

溶液II（室温保存）：20% SDS 25.0 ml，5M NaOH 20.0 ml（最后加入），ddH2O定容至500 ml。

溶液III（4°C保存）：5M乙酸钾 300 ml，冰乙酸 200 ml，ddH2O定容至500 ml。