质粒DNA的提取是基因工程中的核心实验技术之一。本文系统介绍碱裂解法、煮沸法等常用小量提取方法，以及大量提取与纯化流程，并涵盖琼脂糖凝胶电泳鉴定、感受态细胞制备、转化及PCR技术等配套实验，为分子生物学研究提供完整参考。
一、大肠杆菌质粒DNA的提取
质粒DNA的提取是基因工程中的一项基本实验技术。以下介绍最常用的碱裂解法，适用于小量质粒DNA提取，所得产物可直接用于酶切、PCR扩增和测序分析。
碱裂解法步骤：
1. 将含质粒的大肠杆菌按1%接种于2 mL LB培养基中，37℃振荡培养过夜。
2. 取1.5 mL菌液于Ep管中，4000 rpm离心3 min，弃上清。
3. 加入0.1 mL溶液I（1%葡萄糖，50 mM/L EDTA pH 8.0，25 mM/L Tris-HCl pH 8.0），充分重悬菌体。
4. 加入0.2 mL溶液II（0.2 M/L NaOH，1% SDS），轻轻翻转混匀，冰浴5 min。
5. 加入0.15 mL预冷溶液III（5 M/L KAc，pH 4.8），轻轻翻转混匀，冰浴5 min。
6. 10,000 rpm离心20 min，取上清至新Ep管。
7. 加入等体积异戊醇，混匀后于-20℃静置10 min。
8. 10,000 rpm离心20 min，弃上清。
9. 用70%乙醇0.5 mL洗涤一次，抽干液体。
10. 待沉淀干燥后，溶于0.05 mL TE缓冲液。
煮沸法步骤：
1. 将1.5 mL培养液倒入Ep管，4℃下12,000 g离心30秒。
2. 弃上清，倒置管于卫生纸上流尽液体。
3. 将菌体沉淀悬浮于120 μL STET溶液中，涡旋混匀。
4. 加入10 μL新配制的溶菌酶溶液（10 mg/mL），涡旋振荡3秒。
5. 将Ep管放入沸水浴中，50秒后立即取出。
6. 4℃下12,000 g离心10分钟。
7. 用无菌牙签去除细菌碎片。
8. 取20 μL进行电泳检查。
注意：煮沸法可从固体培养基上挑取单个菌落直接提取；溶菌酶浓度不宜过高；提取的质粒DNA中可能含有RNA，但不影响后续酶切、连接等实验。
二、质粒DNA的大量提取和纯化
在制作酶谱、测序、制备探针等实验中，需要高纯度、高浓度的质粒DNA，常用碱法大量提取后经柱层析或氯化铯梯度离心纯化。
碱法大量提取步骤：
1. 取250 mL培养至对数生长后期的含质粒细菌培养液，4℃下5000 g离心15分钟，弃上清。
2. 将细菌沉淀重悬于50 mL冰预冷的STE中（可省略）。
3. 同步骤1离心收集细菌。
4. 将沉淀重悬于5 mL溶液I中，充分悬浮。
5. 加入12 mL新配制的溶液II，缓缓颠倒离心管数次，冰浴10分钟。
6. 加入9 mL冰预冷的溶液III，摇动混匀，冰上放置15分钟，形成白色絮状沉淀。
7. 4℃下5000 g离心15分钟。
8. 取上清，加入50 μL RNA酶A（10 mg/mL），37℃水浴20分钟。
9. 加入等体积饱和酚/氯仿，振荡混匀，4℃下12,000 g离心10分钟。
10. 取上层水相，加入等体积氯仿，振荡混匀，4℃下12,000 g离心10分钟。
11. 取上层水相，加入1/5体积的4 M/L NaCl和10% PEG（分子量6000），冰上放置60分钟。
12. 4℃下12,000 g离心15分钟，沉淀用数毫升70%冰冷乙醇洗涤，4℃下12,000 g离心5分钟。
13. 真空抽干沉淀，溶于500 μL TE或水中。
注意：提取过程尽量保持低温；加入溶液II和III后应轻柔混匀，切忌剧烈振荡；RNA酶A需先经80℃加热1小时以灭活DNA酶。
三、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定
琼脂糖是从海藻中提取的线状高聚物，应选用电泳纯级别。水平板凝胶是常用装置，凝胶浸没在缓冲液中进行电泳。制备时，将琼脂糖在缓冲液中熔化后倒入胶模，凝固后形成固体基质。电泳后，将凝胶放入含溴化乙锭（EB）的染液中染色10分钟，在紫外灯下观察。
四、大肠杆菌感受态细胞的制备
感受态细胞能摄入外源DNA，是转化实验的关键。常用CaCl₂法制备：
1. 取1%大肠杆菌接种于2 mL LB培养基，37℃振荡培养过夜。
2. 取0.1 mL过夜培养物转种于10 mL LB培养基，37℃振荡培养3小时至OD600=0.3。
3. 将培养物倒入1.5 mL离心管，冰浴10分钟。
4. 4℃下4000 rpm离心5分钟，去上清。
5. 将菌体悬浮于15 mL冰冷的0.1 M CaCl₂溶液中，置冰上30分钟。
6. 4℃下4000 rpm离心10分钟，去上清。
7. 将菌体悬浮于0.1 mL CaCl₂溶液中，冰浴放置4-12小时备用。
五、质粒DNA高频转化大肠杆菌
感受态细胞最好新鲜制备，DNA浓度不宜过高。步骤：
1. 取一管新制备的感受态细胞。
2. 取0.03 mL感受态细胞与4 ng质粒DNA混匀，冰浴30分钟。
3. 将Ep管置于42℃水浴热冲击2分钟，立即置于冰上1分钟。
4. 加入70 μL LB培养基混匀，37℃培养30分钟。
5. 涂布于含适当抗生素的LB平板。
6. 37℃培养过夜，长出的菌落即为阳性克隆。
六、线性质粒DNA 5'-粘性末端去磷酸化
酶切后的质粒DNA 5'端带有磷酸基团，易自身环化。使用碱性磷酸酶（CIAP）去除5'磷酸基团可降低自身环化，提高连接效率。步骤：
1. 质粒DNA与CIAP及Buffer在37℃水浴30分钟。
2. 补充CIAP，再37℃水浴30分钟。
3. 加入EDTA至终浓度5 mM，75℃加热10分钟失活CIAP。
4. 冷却至室温，酚-氯仿抽提，乙醇沉淀浓缩。
5. 抽干，加适量TE溶解。
七、聚合酶链式反应（PCR）技术
PCR是一种选择性体外扩增DNA片段的方法，由热变性-复性-延伸循环组成。典型反应体系如下：
PCR反应体系（25 μL）：
14.0 μL PCR水
2.5 μL 10× Taq Buffer（终浓度1×）
1.5 μL MgCl₂（25 mM，终浓度1.5 mM）
4.0 μL dNTP Mix（各1.25 mM，终浓度各0.2 mM）
0.25 μL Primer 1（100 pmol/μL，终浓度1 μM）
0.25 μL Primer 2（100 pmol/μL，终浓度1 μM）
0.5 μL 模板DNA
0.5 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL）
循环参数：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒（30-35个循环）；72℃终延伸5分钟。