描述

农杆菌质粒DNA小量提取是一种从农杆菌中提取质粒DNA的经典实验方法，适用于分子克隆和遗传转化研究。本方案基于碱裂解法，结合溶菌酶处理以提高裂解效率，适用于携带Ti质粒或衍生载体的农杆菌菌株。

实验步骤

1. 挑取单菌落接种于2 mL LB或YMB培养基（含适当抗生素），设置3-4管培养物，培养至稳定期后合并细胞。
2. 在28°C振荡培养至稳定期。
3. 取1.5 mL菌液分装至4-5个Eppendorf管中，14,000 rpm离心3分钟。
4. 弃上清，用100 μL冰预冷的裂解缓冲液重悬沉淀，涡旋混匀。注意：裂解缓冲液需在使用前加入少量溶菌酶（每1 mL缓冲液加一小勺溶菌酶）。通过反复吸打使沉淀分散。
5. 涡旋10秒，室温孵育30分钟。
6. 涡旋后加入200 μL 0.2 M NaOH/1.0% SDS溶液（现配），轻轻混匀。
7. 室温孵育10-30分钟（孵育时间越长效果越好），加入150 μL冰预冷的3 M NaOAc（pH 4.8），混匀后冰浴5分钟，溶液应变为白色絮状。
8. 14,000 rpm离心5分钟，可见表面白色浮渣。
9. 转移上清至新管，加入等体积酚:氯仿（1:1），混匀。
10. 14,000 rpm离心5分钟。
11. 取上层水相至新管，加入1 mL -20°C预冷的无水乙醇。
12. 弃乙醇，用1 mL -20°C预冷的70%乙醇洗涤沉淀。
13. 14,000 rpm离心3分钟。
14. 弃乙醇，真空干燥沉淀。
15. 用50 μL TE缓冲液重悬沉淀，反复吸打溶解。
16. 室温孵育5-10分钟，加入1 μL 1 mg/mL RNase A，混匀。

试剂配方

裂解缓冲液：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-Cl（pH 5.8），10 mM EDTA，4 mg/mL溶菌酶（使用前加入）。

注意事项

1. 农杆菌细胞壁较厚，溶菌酶处理可提高裂解效率。
2. 所有离心步骤均在室温进行，除非特别说明。
3. 酚:氯仿抽提后取上清时避免吸入中间相。
4. 最终DNA可用TE或无菌水溶解，-20°C保存。