描述

二元BAC（BIBAC）载体适用于通过农杆菌介导的高分子量DNA植物转化。BIBAC载体基于细菌人工染色体（BAC）文库载体，同时也是用于农杆菌介导植物转化的二元载体。BIBAC载体包含大肠杆菌F质粒的最小复制起始区和发根农杆菌Ri质粒的最小复制起始区，因此在大肠杆菌和根癌农杆菌中均以单拷贝质粒形式复制。BIBAC载体的T-DNA可转移至植物核基因组中。已发表的实例包括将30 kb的酵母基因组DNA片段和150 kb的人类基因组DNA片段插入BIBAC载体并转化至植物中。

步骤

1. 对BIBAC载体进行CsCl纯化。
2. 对目标BAC克隆进行CsCl纯化。
3. 用NotI酶切BAC克隆。
4. 用NotI酶切BIBAC载体。
5. 定量比较BIBAC NotI DNA与高分子量BAC NotI片段。使用λDNA作为标准品，在标准凝胶上分别上样20、50、100和200 ng。
6. 用SAP（虾碱性磷酸酶，USB）或CIAP（BRL）处理BIBAC NotI片段。
7. 设置一系列连接反应，包括使用或不使用磷酸酶处理的BIBAC载体，以及载体与插入片段的比例约为10:1和5:1。建议设置不同比例，因为浓度估算可能不准确。
8. 以下是一个成功连接混合物的示例：BIBAC2载体NotI + CIAP 200 ng（4 μl），BAC克隆NotI（pBeloBAC或衍生物）= 载体（CmR 7 Kb）+ 插入片段（128 Kb）100 ng（7 μl），10X连接缓冲液（NEB）10 μl，T4 DNA连接酶（NEB）2 μl，高质量水（蒸馏、去离子）补至100 μl（75 μl）。
9. 将DNA、载体和水轻轻混合，在60°C孵育10分钟，然后冷却至室温。加入10X连接混合物和酶，在16°C孵育过夜。
10. 取部分连接混合物（30 μl）在室温下对水透析30分钟（非必需，但可增加电穿孔后的菌落数）。
11. 取1 μl用于DH10B细胞的电穿孔。
12. 亚克隆时，通常在Kan平板上涂布，然后复制平板检测CmR（连接内部对照）和Kan+蔗糖，最后打印Kan平板。
13. 应获得一些CmR菌落——它们含有BAC载体——但也表明连接成功。从该连接混合物中检查了38个菌落（来自一次电穿孔）；10个为CmR，所有均为Kan+蔗糖R。但有时也观察到一些蔗糖敏感的CmR菌落，可能是由于CmR基因插入上游且方向相同时sacB基因的通读所致，但尚未验证。
14. 也可将第二次电穿孔产物涂布在Kan+蔗糖平板上，但同样需要复制平板。在某些批次的感受态细胞中，观察到能在Kan+蔗糖上生长但不能在Kan上生长的污染物。此外，任何“不良”连接混合物中都可能产生“垃圾”（缺失、重排）。
15. 通过标准BAC小量制备分析CmS、Kan+蔗糖R菌落。本实验中，16个菌落通过脉冲场凝胶电泳检查，其中8个具有正确大小的插入片段，随后用EcoRI酶切并在标准凝胶上电泳，与原始BAC克隆的限制性酶切图谱进行比较。

修饰BIBAC载体

（例如，将所需的植物选择标记引入pCH20或BIBAC1）
1. 对要修饰的（BIBAC）质粒进行2升规模制备。
2. 限制性酶切按标准方法进行。
3. 如需分离要插入BIBAC的片段，采用标准方法（如prep-a-gene、gelase）。
4. 使用Klenow片段“回切”3'突出端并补平5'突出端以产生平末端，两种活性均使用标准反应条件。
5. 连接反应为标准方法，但可能为平末端连接。对于平末端连接，建议在连接混合物中加入PEG（10%）或使用已含PEG的商业T4 DNA连接酶缓冲液（如BRL），以排除体积，增加反应混合物中末端的浓度。
6. 通常设置一系列连接反应：使用20-50 ng载体，在10 μl（终体积）连接混合物中，插入片段与载体的摩尔比为5-10倍过量。
7. 可设置使用或不使用磷酸酶处理的连接。实践中，CIAP更“完美”高效（用于文库构建），但对于标准克隆，更倾向于使用SAP，因其易于热失活且对平末端活性更好。通常设置+SAP和-SAP两种连接。
8. 应包括标准对照，特别是载体无连接酶对照。不完全酶切的载体是常见的背景来源。在无选择压力的克隆实验中，这一点尤为重要。
9. 当不使用sacB作为选择标记时（即使使用，参见BAC亚克隆部分），建议将转化子涂布在Kan平板上，然后复制平板至Kan+蔗糖。这能提供更准确的信息（因为任何标记都有一定背景，且在感受态细胞制备中观察到能在Kan+蔗糖上生长但并非真正Kan抗性的污染物）。如果将带有BIBAC载体的细胞直接涂布在Kan+蔗糖平板上，可能会得到少量菌落，这些菌落可能含有阻止sacB表达的突变。在强选择压力（存活）下，这种情况会以低频率发生。

配方

（原文无内容）

耗材

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提示

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