描述
破伤风类毒素疫苗的免疫反应是评估婴幼儿和儿童免疫功能的重要指标。通过比较免疫前后特异性抗体的量，可以使用基于ELISA的免疫测定法进行检测。

程序
第一天
1. 在96孔微孔板中涂覆100微升的破伤风类毒素涂层抗原，浓度为0.4微克/毫升，使用涂层缓冲液。
2. 用粘合盖覆盖板，37摄氏度孵育30分钟，然后在4摄氏度下过夜。
第二天
3. 用洗涤液清洗三次，手动或使用自动洗板机。
4. 加入阻断缓冲液，100微升/孔。
5. 盖上并在37摄氏度下孵育一小时。
6. 再次用洗涤液清洗三次。
7. 添加样品（患者和对照血清、空白和非特异性抗体），100微升/孔，重复三次。
8. 盖上并在37摄氏度下孵育一小时。
9. 用洗涤液清洗三次。
10. 添加HRP抗人IgG结合物，100微升/孔。
11. 盖上并在37摄氏度下孵育一小时。
12. 用洗涤液清洗三次。
13. 添加OPD底物溶液，100微升/孔。
14. 在室温下避光孵育。
15. 在450纳米波长下读取光密度，分别在5、10、15和30分钟时记录。
16. 确定标准曲线的线性区域。
17. 计算样品浓度。

配方
1. 破伤风类毒素抗原（Connaught Labs），12毫克/毫升。
2. 单克隆抗人破伤风IgG抗体，0.2微克/毫升，来自人类杂交瘤培养上清液（ATCC; HB-8177）。
3. 样品：免疫前后阳性破伤风对照血清、免疫前后患者血清及非特异性IgG抗体对照上清液。
4. 碳酸氢盐缓冲液片（Sigma Cat #C304）。
5. Tween 20（Sigma或同类供应商）。
6. 磷酸盐缓冲盐水。
7. 牛血清白蛋白（Sigma Cat#A-2153或同类供应商）。
8. HRP（过氧化物酶）结合的特异性山羊抗人IgG抗体，1毫克/毫升（Protos ImmunoResearch，Burlingame, CA, Cat #701）。
9. OPD（邻苯二胺二盐酸盐）过氧化物酶底物片剂（Sigma，Cat# P9187）。
10. 移液器、试管及其他必要的耗材。
11. 96孔平底EIA微孔板（Nunc-immuno plate maxisorp）。
12. ELISA 450nm O.D.读取器（Molecular Devices或同类产品）。
13. 微孔板洗涤机（Denley或同类产品）。

试剂准备
1. 涂层缓冲液：
0.05 M 碳酸氢盐，pH 9.6。
将一片碳酸氢盐缓冲液溶解于100毫升蒸馏水或去离子水中。
可在4摄氏度下保存一周。
2. 阻断/稀释缓冲液：
0.25% BSA（牛血清白蛋白）在PBS（磷酸盐缓冲盐水）中。
0.25克BSA溶解于100毫升PBS中。
准备后立即使用。
3. 洗涤液：
0.02% Tween 20在蒸馏水或去离子水中。
200微升Tween 20溶解于1000毫升蒸馏水或去离子水中。
准备后立即使用。
4. 破伤风涂层抗原：
0.4微克/毫升Connaught破伤风类毒素抗原。
在玻璃容器中，将12毫克/毫升的Connaught破伤风类毒素抗原稀释至涂层缓冲液中，比例为1:30,000。
准备后立即使用。
5. 破伤风类毒素IgG抗体标准：
在稀释缓冲液中准备以下浓度的人类杂交瘤IgG抗体（起始浓度=200微克/毫升）：100、10、1、0.1、0.01、0.001微克/毫升。
准备后立即使用。
6. 患者和对照免疫前后破伤风血清：
将免疫前后患者和阳性对照血清稀释至1:20,000至1:50,000。
准备后立即使用。
7. 背景和非特异性对照：
使用稀释缓冲液作为空白背景孔。
对于破伤风单克隆抗体的对照，将非特异性IgG对照上清液稀释至1:2。
8. HRP（过氧化物酶）结合IgG抗体：
将HRP结合的山羊抗人IgG（γ链特异性）抗体稀释至1:1000。
准备后立即使用。
9. OPD（邻苯二胺二盐酸盐）底物溶液：
取出一片OPD片剂（银箔包装）和一片尿素氢过氧化物片剂（金箔包装），让其在室温下恢复。
打开每个包装，不要触摸片剂，将其放入含有20毫升蒸馏水或去离子水的50毫升试管中，涡旋至溶解。
准备后立即使用，存放在黑暗处，使用后按生物危害材料处理规范处理。

注意事项
在实验过程中，确保遵循所有生物安全规程，并对所有试剂和样本进行适当的处理和废弃。