背景介绍

本实验流程旨在提高对HIV-1特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的检测敏感性，采用抗原刺激外周血单核细胞（PBMC）的方法。通过使用重组痘病毒载体表达HIV-1基因产物，感染自体EB病毒转化的B淋巴母细胞系（B-LCL），并利用紫外线及Psoralen处理以灭活病毒和细胞核酸，同时保持抗原性。随后将PBMC与刺激细胞按10:1比例共培养10-14天，以促进CTL扩增。本流程适用于任何痘病毒载体。

实验步骤

一、EBV转化B淋巴母细胞系（B-LCL）
1）取10×10⁶新鲜PBMC，加入2 ml含EBV的B-958猕猴细胞无细胞上清液，在37℃孵育2小时。
2）加入8 ml R-20培养基和环孢素A（终浓度0.1 μg/ml），转移至T-25培养瓶，37℃、5% CO₂孵育2-3周。
3）B-LCL细胞系维持浓度在0.5-1.0×10⁶ B-LCL/ml，实验前需至少分裂三次。

二、抗原特异性体外刺激培养
1）提前14-18小时，用适当痘病毒载体感染自体B-LCL（每4-5×10⁶ PBMC需1×10⁶ B-LCL），37℃孵育90分钟，偶尔混匀。
2）洗涤后在R-10培养基中继续孵育14-18小时，检测蛋白表达。
3）用冷培养基洗涤一次，重悬于冷培养基，加入Psoralen（终浓度10 μg/ml）。
4）转移至T25瓶，置于长波紫外灯箱上，轻轻摇晃，照射10-15分钟。
5）再次洗涤三次，计数后重悬于含rIL-2的R-10培养基（1×10⁶/ml），感染后B-LCL存活率应>80%。

三、PBMC刺激
1）常规Ficoll分离血液，计数后重悬于含rIL-2的培养基（2.5×10⁶ PBMC/ml）。
2）在24孔板中加入1.6 ml PBMC悬液和0.4 ml刺激细胞悬液，PBMC与刺激细胞比例为10:1，最终体积2 ml。
3）每3-4天更换1 ml新培养基，培养10-14天。

四、铬释放分析（Chromium Release Assay）
1）提前14-18小时，感染B-LCL并标记51Cr，作为“热靶细胞”；另制备未标记的“冷靶细胞”。
2）效应细胞（刺激后PBMC）洗涤后按2.5×10⁶/ml重悬，进行1:2稀释，设置E/T比为50:1、25:1、12.5:1等。
3）于96孔板中加入效应细胞、冷靶细胞（50:1），最后加入热靶细胞。
4）设置自发释放和最大释放对照，孵育6小时后离心，收集上清，使用γ计数器检测铬释放。
5）计算公式：%细胞毒性=[（效应孔cpm-自发释放cpm）/（最大释放cpm-自发释放cpm）]×100，取三孔均值。实验组减去对照组即为HIV特异性裂解率。

试剂与耗材

Psoralen（4'氨基甲基-4-5'-8三甲基Psoralen盐酸盐）、Psoralen储备液（0.5 mg/ml，PBS/Ca²⁺、Mg²⁺去除）、24/48孔板、96孔板、15 ml离心管、T25培养瓶、51Cr钠铬酸盐、B-958猕猴细胞EBV上清液、R-20/R-10培养基（含RPMI、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素、胎牛血清）、rIL-2（20 U/ml）。

实验提示

建议严格按照细胞比例与孵育时间操作，确保B-LCL感染后存活率，铬释放分析需设置冷靶细胞以抑制非特异性裂解，提高检测准确性。