背景介绍

ELISPOT（酶联免疫斑点法）是一种高度敏感的免疫学实验技术，最初用于检测和计数分泌抗体的B细胞。近年来，该技术已广泛应用于检测细胞因子分泌，尤其在T细胞功能分析、疫苗评价及免疫应答研究中具有重要意义。ELISPOT通过在膜上捕获单个细胞分泌的蛋白，形成可视化斑点，便于定量分析。

实验原理

ELISPOT实验流程包括：将待检测细胞接种于预先包被特异性捕获抗体的膜上，经过适当培养后，细胞分泌的目标蛋白被捕获。随后，使用针对该蛋白另一表位的检测抗体进行识别，并通过HRP酶标记和底物显色，形成可计数的斑点，代表单个分泌细胞。

实验步骤

1. 材料准备：96孔ELISPOT板（Millipore, MAIPS4510）、细胞因子捕获与检测抗体、RPMI-1640培养基（含10% FBS）、HRP标记的Avidin（AV-HRP, 18-4100）、AEC底物（Sigma, A-5754）、各类缓冲液、移液器、冰箱、培养箱、洗板器、ELISPOT读板仪或显微镜。

2. 板包被：用100 μl/孔、10 μg/ml的纯化捕获抗体在包被缓冲液中包被ELISPOT板，4℃孵育过夜。

3. 洗板：用洗涤缓冲液洗板6次。

4. 阻断：用200 μl/孔的完全RPMI-1640室温孵育1小时。

5. 接种细胞：将激活后的细胞以100 μl/孔接种，37℃、5% CO2湿润培养箱孵育24小时。可先在普通培养板进行梯度稀释（如106/孔，三重复，1:3或1:4稀释），再转移至ELISPOT板。

6. 洗板：用洗涤缓冲液洗5次，再用蒸馏水洗1次。

7. 检测抗体孵育：加100 μl/孔、1 μg/ml的生物素标记检测抗体于检测缓冲液中，室温孵育2小时。

8. 洗板：用洗涤缓冲液洗6次。

9. 加酶标记：加100 μl/孔、1/1000稀释的AV-HRP于检测缓冲液中，室温孵育30分钟。

10. 洗板：用洗涤缓冲液洗6次。

11. 显色：加100 μl/孔AEC底物溶液，室温显色20-60分钟，直至斑点出现。

12. 洗板：用200 μl/孔蒸馏水洗3次。

13. 干燥与计数：空气干燥板后，使用解剖显微镜或ELISPOT读板仪计数斑点。

缓冲液配方

1. ELISPOT包被缓冲液（D-PBS，pH 7.2）：
8 g NaCl
0.2 g KCl
1.44 g Na2HPO4·H2O
0.24 g KH2PO4
加去离子水至1 L，调pH至7.2，灭菌后4℃保存。

2. 检测缓冲液：1X PBS + 10% FBS。

3. 洗涤缓冲液：1X PBS + 0.05% Tween-20。

4. AEC底物溶液：溶解4 mg AEC于1 ml DMF（N,N-二甲基甲酰胺），加14 ml 0.1 M磷酸-柠檬酸缓冲液（pH 5.0），0.45 μm过滤，使用前加入10 μl 30% H2O2。

5. 1X PBS：80 g NaCl、11.6 g Na2HPO4、2 g KH2PO4、2 g KCl，加去离子水至10 L，调pH至7.0。

6. 0.1 M磷酸-柠檬酸缓冲液（pH 5.0）：
柠檬酸9.6 g加去离子水至500 ml
磷酸二钠14.2 g加去离子水至500 ml
将磷酸二钠溶液加入柠檬酸溶液至pH 5.0，1:1稀释。

实验提示

建议所有操作均在无菌条件下进行，缓冲液需新鲜配制或低温保存。斑点计数时应避免主观误差，推荐使用自动读板仪。