背景介绍

过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）免疫组化技术是一种经典的组织免疫学方法，广泛用于石蜡切片中抗原的定位与鉴定。该方法通过抗体与抗原的特异性结合，并利用过氧化物酶底物显色，能够实现高灵敏度的检测，适用于免疫组织化学、病理诊断及基础生物学研究。

实验步骤

1. 石蜡切片脱蜡后转入100%酒精。
2. 用0.5%过氧化氢甲醇溶液阻断内源性过氧化物酶，作用30分钟。
3. 转入Tris-盐缓冲液（20℃）。
4. 用含0.1%氯化钙的0.05%胰蛋白酶Tris-盐缓冲液（37℃）处理，40分钟，胰蛋白酶需预热后立即使用。
5. 用Tris-盐缓冲液（20℃）多次洗涤。
6. 用含1%正常血清的PBS（P.B.S./N.S.）处理两次，每次5分钟，血清来源与二抗一致。
7. 加入特异性一抗（免疫球蛋白稀释1:100-1:250，激素稀释1:250-1:500），在湿室中孵育30分钟（必要时可延长至12-24小时）。
8. 用P.B.S./N.S.洗涤两次，每次5分钟。
9. 加入二抗（抗一抗宿主IgG，稀释1:40），孵育20分钟。
10. 用P.B.S./N.S.洗涤两次，每次5分钟。
11. 加入PAP复合物（与一抗宿主一致，稀释1:40），孵育20分钟。
12. 用P.B.S./N.S.洗涤两次，每次5分钟。
13. 用0.05M pH5醋酸缓冲液（用于乙基咔唑显色）或TBS（用于DAB显色）冲洗。
14. 加入过氧化物酶底物溶液（乙基咔唑或DAB），显色5分钟。
15. 用蒸馏水冲洗。
16. 用Mayer苏木素染色30秒，流水蓝化。
17. 用甘油明胶或适当水性封片剂封片（DAB显色需酒精脱水、二甲苯或Histo-Clear透明后用DPX封片）。

实验对照

1. 省略一抗，仅用洗涤/阻断液，继续后续步骤（检测二抗和底物特异性）。
2. 用不相关抗体替换一抗（检测一抗特异性）。
3. 用同种动物的正常（非免疫）血清替换一抗（检测一抗特异性）。

主要试剂配方

Tris-盐缓冲液（pH 7.8）
Tris 0.2M（10份）、0.1M HCl（13份）、生理盐水0.85%（17份），混合。

胰蛋白酶溶液
5%胰蛋白酶8ml、5%氯化钙16ml、Tris-盐缓冲液776ml。

0.05M醋酸缓冲液
0.1M醋酸（2.85ml无水醋酸于500ml蒸馏水）50ml、0.1M醋酸钠（4.1g无水或6.8g三水合于500ml蒸馏水）150ml、蒸馏水200ml。

乙基咔唑显色剂
0.002g 3-氨基乙基咔唑溶于0.5ml N,N-二甲基甲酰胺（干燥容器），加9.5ml pH5 0.05M醋酸缓冲液，立即使用。

DAB显色剂
3,3-二氨基联苯四盐酸盐6mg、Tris-盐缓冲液10ml、3%过氧化氢0.1ml。

0.01M磷酸缓冲盐水（PBS）
NaCl 17g、Na2HPO4 2.67g、NaH2PO4 0.41g，补足至2升蒸馏水。

技术提示

1. 胰蛋白酶处理温度需准确，避免组织损伤。
2. 显色剂需现配现用，避免失效。
3. 各步洗涤充分，减少背景。

应用与意义

该方法适用于组织抗原的定位、疾病相关蛋白检测及基础生物学研究，具有高灵敏度和特异性。