背景介绍

离体视网膜免疫组化是一项常用于研究视网膜细胞类型、功能及其分子机制的实验技术。通过将视网膜组织解离为单细胞悬液，并进行免疫组化染色，可以高效鉴定细胞表面或内部的特定蛋白表达。本方法适用于新鲜或培养的视网膜组织，便于后续细胞计数与分型分析。

实验步骤

1. 组织洗涤：将新鲜解剖或培养的视网膜组织在预热的PBS中（6 ml，6 cm培养皿）洗涤。

2. 消化处理：转移至Eppendorf管，加入约200微升PBS和20微升100X胰蛋白酶溶液，37℃孵育5分钟。

3. 制备载玻片：孵育期间，将1X Poly-D Lysine（多聚-D-赖氨酸，稀释于1X PBS）涂于载玻片表面，孵育5分钟后用PBS洗涤两次，保持湿润。

4. 组织解离：用p1000移液器反复吹打3-5次，返回37℃水浴2-4分钟，再次吹打，直至获得单细胞悬液。

5. 抑制消化：加入20微升大豆胰蛋白酶抑制剂，混匀后加入2微升DNaseI，37℃孵育5分钟，再次吹打，补加培养基至1.5 ml。

6. 移液与贴壁：将细胞悬液转移至载玻片（每腔室约105个细胞），37℃孵育15-30分钟。

7. 固定：吸去培养基，立即用4%多聚甲醛固定5分钟。

8. 洗涤与阻断：用PBS洗涤两次，3%过氧化氢处理5分钟，PBS洗涤两次，阻断5-10分钟。

9. 一抗孵育：加入一抗（参考Dyer和Cepko文献稀释比例），孵育30分钟。

10. 洗涤与二抗孵育：PBS洗涤三次，加入1:500稀释的二抗，孵育30分钟。

11. ABC反应：PBS洗涤三次，加入ABC试剂，PBS洗涤三次，TNB阻断一次，进行tyramide信号扩增（每片混合150微升扩增稀释液与1微升tyramide，或自制稀释至1:50,000）。孵育10分钟后PBS洗涤终止反应。

12. DAPI染色：用DAPI染色5分钟，PBS洗涤两次，最后用Gelvatol封片。

试剂配方

胰蛋白酶溶液（100X）：10 mg/ml于1X PBS（Sigma #T2271）

大豆胰蛋白酶抑制剂（100X）：10 mg/ml于1X PBS（Sigma #T6522）

DNaseI（1000X）：2 mg/ml于HBSS（Sigma #D4513）

视网膜培养基：45% HAMS F-12（Gibco #11765-054）、45% DME（Gibco #10313-021）、10% FCS（HyClone）、胰岛素（5 mg/ml，1000X）、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、HEPES（各10 ml/L）

多聚甲醛溶液：20%多聚甲醛溶液（200 g于1 L，含1 ml 10N NaOH，65℃加热溶解，分装-20℃保存），使用时混合100 ml 20%多聚甲醛、50 ml 10X PBS，补至500 ml，过滤后4℃保存两周。

Poly-D Lysine（1000X）：500 mg于50 ml无菌PBS，分装-20℃保存。

阻断液：1X PBS、2%正常血清（驴、兔、羊）、0.5% Triton X-100，4℃保存1-2周。

DAPI（1000X）：50 mg于10 ml 50%甲醇，避光-20℃保存。

其他试剂：生物素化二抗（Vector labs Inc.）、ABC生物素/链霉亲和素（Vector labs Inc.）、tyramide试剂（见T.4协议）、8腔室载玻片（Cel-line/Eric Scientific Co.，12 mm方形，特氟龙涂层）。

实验提示

建议严格按照细胞计数标准操作，所有溶液需预热，细胞贴壁后立即固定，避免干燥。抗体稀释比例需参考文献，信号扩增步骤可根据实验需求调整。