背景介绍

神经生长因子（NGF）是调控神经系统发育和功能的重要蛋白。酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种高灵敏度、特异性强的检测方法，广泛用于定量分析NGF在脑及外周组织中的表达。本方法参考Weskamp和Otten（1987）文献，详细阐述NGF ELISA实验的操作流程、标准品制备、数据分析及相关溶液配方。

实验步骤

第一天：抗体吸附
使用山羊抗小鼠（GAM）NGF多克隆抗体和山羊IgG（GIG）预免疫血清作为对照。分别将GIG和GAM加入涂层缓冲液，分配到96孔板的不同排。用封膜防止溶液蒸发，4℃旋转孵育过夜。

第二天：封闭与样品准备
用封闭缓冲液封闭孔板，4℃孵育至少1小时。采用真空吸管依次移除溶液并进行三次洗涤。样品需稀释并加0.1% Tween以提高NGF回收率，冰上超声匀浆后离心，取上清用于检测。标准品NGF需温和混匀，避免剧烈振荡导致蛋白失活。

标准品制备
按表格稀释NGF，制备不同浓度标准品（100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56 pg/孔），并用样品缓冲液稀释。每板需设置完整标准曲线以校正板间差异。

蛋白回收率检测
通过向样品中添加已知量NGF（加样）并与原样品比较，计算回收率。

板设计与加样
标准品和样品在板内交替分布，低浓度标准品设置四重复，样品分配到剩余孔。加样后4℃旋转孵育过夜。

第三天：单克隆抗体孵育
洗板后加入单克隆抗NGF抗体（1:200），含Tween的封闭缓冲液稀释，4℃旋转孵育过夜。

第四天：二抗与链霉亲和素孵育
洗板后加入1:625生物素化山羊抗鼠IgG，6小时4℃孵育。随后加入1:2000过氧化物酶标记链霉亲和素，室温旋转孵育1小时。

显色与读板
显色前准备OPD底物溶液，加入H2O2后快速分配至各孔，室温暗处孵育10分钟。反应结束后加入硫酸终止反应，使用492 nm波长读板，记录吸光值。

溶液配方

PBS缓冲液（50 mM）
磷酸二氢钠1.50 g，磷酸二氢钠6.53 g，氯化钠116.38 g，蒸馏水至1 L。

涂层缓冲液（pH 9.6）
叠氮化钠0.2 g，碳酸氢钠2.93 g，碳酸钠1.71 g，蒸馏水至1 L。

洗涤缓冲液
10% Tween 20 ml，10 mM PBS 4 L。

封闭缓冲液
10 mM PBS 99 ml，胎牛血清1 ml。

样品缓冲液
0.5% BSA 2.5 g，Aprotinin 0.0005 g，苯乙酮氯化物0.022 g，PMSF 0.0086 g（溶于400 μl 95%乙醇），10 mM PBS至500 ml。

底物缓冲液（pH 5.0）
磷酸二氢钠25.7 ml（2.84 g/100 ml=0.2 M），柠檬酸24.3 ml（1.92 g/100 ml=0.1 M），蒸馏水至100 ml。

硫酸（2.5 M）
硫酸137.5 ml，蒸馏水至1 L。

主要试剂与供应商
详见原文列出的Sigma、Pierce、Zymed、Calbiochem等化学品目录号。

参考文献
Weskamp, G., and Otten, U. (1987). An enzyme-linked immunoassay for nerve growth factor (NGF): A tool for studying regulatory mechanisms involved in ngf production in brain and in peripheral tissues. Journal of Neurochemistry, 48 (6),1779-1786.