在含有蔗糖的缓冲液（"Mito-Buffer"）中裂解细胞的目的是防止线粒体意外破裂，从而避免线粒体蛋白（如细胞色素c）泄漏到细胞质中。裂解通过使用研杵匀浆器实现；使用研杵的次数以裂解细胞但保持线粒体完整为宜，这取决于细胞系。对于PC3、DU145、JCA1和ALVA31细胞系，多达50次研杵被认为是合理的，而LNCaP细胞的线粒体似乎更脆弱，应限制在30次以内。如果需要分离不同的细胞组分，细胞裂解物将以不同的速度离心，以依次获得细胞核、线粒体和细胞质。
具体步骤如下：
1. 通过胰蛋白酶消化收集细胞。
2. 将细胞在200xg下离心5分钟。
3. 用5ml新鲜的RPMI培养基洗涤细胞一次。
4. 用5ml冰冷的PBS洗涤细胞一次。
5. 将细胞重悬于Mito-Buffer中（约5,000,000个细胞在300μl缓冲液中）。
6. 在冰上使用玻璃匀浆器，通过适当次数的研杵裂解细胞。
7. 将裂解物在4℃下以800g（Eppendorf离心机中的3000rpm）离心20分钟。
8. 沉淀包含细胞核和完整细胞，而上清液是包含线粒体的细胞质。如果需要，上清液可以再次以800g离心以去除残留的细胞核。
9. 然后将上清液在4℃下以10,000g（11,000rpm）离心20分钟。沉淀包含线粒体，应至少用Mito-Buffer洗涤一次，然后再次在10,000g下离心。线粒体可以通过在冰上用TNC缓冲液孵育15分钟来裂解。
10. 上清液在4℃下以16,000g（14,000rpm）离心至少20分钟，以去除残留的线粒体。如果条件允许，应在超速离心机中以100,000g离心1小时，以去除残留的膜结构。
Mito-Buffer配方：
成分：20mM HEPES（pH 7.5）、1mM EGTA、1mM EDTA、10mM KCl、1.5mM MgCl2、1mM DTT、0.1mM PMSF、2μg/ml Leupeptin、2μg/ml Pepstatin、2μg/ml Aprotinin。
TNC-Buffer配方：
成分：10mM Tris-acetate（pH 8.0）、0.5% NP-40、5mM CaCl2、1mM DTT、0.1mM PMSF、2μg/ml Leupeptin、2μg/ml Pepstatin、2μg/ml Aprotinin。