阿拉伯芥(Arabidopsis)是植物生物学研究中的一个重要模型生物。真空浸润转化是一种常用的基因转化方法,通过将植物组织浸润在含有外源基因的溶液中,利用真空条件促进基因的进入。以下是阿拉伯芥真空浸润转化的绿色实验室协议。
1. 种植阿拉伯芥种子:在轻质塑料盆中种植阿拉伯芥种子,使用阿拉伯芥土壤混合物,浇水并添加适量的肥料。
2. 生长条件:将植物放在16小时光照/8小时暗照的条件下,温度控制在20-22°C之间,每周一次从下方浇水,添加约0.5英寸的水。
3. 准备Agrobacterium:将构建好的质粒转化入Agrobacterium tumefaciens GV3101菌株中,使用50mg/L的利福平和25mg/L的庆大霉素作为选择性标记。
4. 浸润转化:将植物浸润在含有Agrobacterium的溶液中,使用真空条件促进基因的进入。浸润溶液的配方为:2.2g/L的MS盐,1X的B5维生素,50g/L的蔗糖,0.5g/L的MES,pH调节到5.7,添加0.044μM的苯甲基氨基嘌呤和200μL/L的Silwet L-77。
5. 真空处理:将浸润后的植物放在真空室中,抽真空到400mmHg,保持5分钟,然后快速释放真空。
6. 生长和选择:将转化后的植物放在生长室中,条件与前相同。5-7天后,转化的植物将显现为绿色植物,将其转移到含有抗生素的选择性培养基中,继续生长和选择。
7. 验证转化:通过PCR或其他分子生物学方法验证转化的植物中是否存在外源基因。