背景介绍：

李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种重要的食源性病原菌，研究其基因功能及致病机制需要高效的遗传操作技术。转化技术是分子生物学中常用的基因导入手段，本文详细介绍了李斯特菌感受态细胞的制备及电转化方法，旨在为相关研究提供实用的实验指导。

实验流程：

第一天：制备感受态李斯特菌细胞

1. 配制所需试剂：

• 2倍浓度脑心浸液培养基（2X BHI）：称取37克BHI粉末，溶解于500毫升水中，121℃高压灭菌15分钟。
• 1摩尔蔗糖溶液：称取171.15克蔗糖，溶解于500毫升水中，过滤灭菌。
• BHI-0.5M蔗糖培养基：等体积混合2X BHI和1M蔗糖溶液。

2. 在15毫升BHI-0.5M蔗糖培养基中接种李斯特菌，进行过夜培养。

第二天：细胞亚培养及感受态制备

3. 将过夜培养液以1:20比例接种于250毫升BHI-0.5M蔗糖培养基中。

4. 在37℃培养，至OD600达到0.4（约4小时），加入新鲜青霉素G（终浓度12.5μg/ml，使用12.5mg/ml青霉素G储备液稀释），以促进细胞膜形成孔洞。

5. 继续培养至OD600达到0.7（约2.5小时），随后将培养瓶置于冰上冷却10分钟。

6. 以10,000转/分钟离心5分钟（4℃），收集细胞。

7. 用冰冷的0.5M蔗糖溶液重悬细胞，体积约200毫升，轻轻旋转混匀。

8. 重复离心和洗涤步骤两次，保持低温操作。

9. 最终将细胞重悬于2.5毫升0.5M蔗糖中，形成浓稠的细胞悬液。

10. 分装50-100微升/管，制备好的感受态细胞可立即用于电转化，或-80℃保存备用。

电转化步骤：

11. 将50微升感受态李斯特菌细胞与少于5微升（约1微克）目标DNA混合，保持冰上冷却。

12. 在电转化仪中施加12.5 kV/cm的电场强度，脉冲时间约5毫秒。

13. 电转化后立即加入950微升BHI-0.5M蔗糖培养基，30℃摇床培养2小时以促进细胞恢复和表达抗性基因。

14. 将培养液涂布于选择性培养基上，30℃培养至少2天，观察转化菌落形成。

实验小贴士：

李斯特菌与大肠杆菌不同，转化效率较低，获得的转化子数量较少，实验时需耐心等待。