描述
本文介绍了拟南芥根部转化实验的详细步骤，包括种子消毒、根培养、农杆菌感染及肿瘤形成检测等过程。
实验步骤
种子消毒
1. 将拟南芥种子在50%漂白水和0.1% SDS溶液中消毒10分钟。
2. 用无菌的去离子水冲洗5次。
3. 将50颗种子放置于含有50μg/ml卡那霉素或10μg/ml磷酸霉素的B5培养基平板上，同时加入100μg/ml的提米丁以抑制可能被种子外壳困住的农杆菌生长。
4. 将平板放置在4℃下保存2天。
根培养
5. 在生长箱中（23℃，10小时光照，14小时黑暗）培养种子7-10天。
6. 将幼苗转移到含有B5培养基和提米丁的婴儿食品罐中，至少培养10天。当根系足够长以获取至少60个根段时，即可进行后续处理。植物应在开花之前进行处理。
农杆菌感染
1. 将拟南芥根放入培养皿中，倒入一些无菌水。
2. 从植物上切下根部，并将植物放回婴儿食品罐中。将根切成0.3-0.5厘米长的段。
3. 将根段束转移到不含抗生素的MS基础培养基上。
4. 加入2-3滴细菌溶液（将农杆菌在含有适当抗生素的YEP培养基中培养至109个细胞/ml的浓度，洗涤细胞一次后用0.9% NaCl重悬，浓度为108个细胞/ml），覆盖根束，静置10分钟。
注意：细菌的离心应在微量离心机中以最高速度离心1分钟。对于某些实验，您可能希望将细菌重悬至Klett值为100或更低。所有根段必须在切割后2小时内进行感染，切勿在感染前长时间放置根段。
6. 移除大部分细菌溶液，用Parafilm密封培养皿，在20℃的生长箱中共培养40-50小时。
7. 在共培养40-50小时后，用含有提米丁（100μg/ml）的去离子水冲洗根段，或将感染的根段刮掉，转移到根据您将要进行的实验所需的不同培养基上。对于初步筛选突变体，将根分成小束（最多5个根段/束）。对于二次筛选和定量，分成单个根段；不要使用根束。每个平板上必须至少有60个根段。
8. 在23℃下培养平板，并在4-5周后进行评分。
9. 在评分肿瘤形成表型时，不仅要记录产生肿瘤的根段百分比，还要指明肿瘤的形态（小黄肿瘤、大黄肿瘤、小绿肿瘤或大绿肿瘤）。每种形态类别的百分比也应记录（您可以使用条形图，其中条形分为4个不同颜色的部分，每种颜色代表一种形态类别）。
瞬时GUS活性检测
1. 将根束转移到含有100μg/ml提米丁的愈伤组织诱导培养基（CIM）上，密封平板并放置在生长箱中。
2. 2-4天后取出根段，并在37℃的X-gluc溶液中染色过夜，或在1.5毫升的Eppendorf管中研磨根段，通过荧光法测量特定的GUS活性。
肿瘤形成检测
1. 将根转移到含有100μg/ml提米丁的MS基础培养基上。
2. 用双层Parafilm密封平板，并在生长箱中培养4-5周。感染后约2周，您应该能看到小肿瘤出现。
转化为耐卡那霉素或磷酸霉素的愈伤组织
1. 将根转移到含有100μg/ml提米丁和50μg/ml卡那霉素或10μg/ml磷酸霉素的愈伤组织诱导培养基（CIM）上。
2. 用双层Parafilm密封平板，并在生长箱中培养4-5周。感染后约2周，您应该能看到小黄愈伤组织出现。
配方
1. MS基础培养基（1升）
4.32克MS最小盐（Gibco）
0.5克MES
1毫升维生素储备液（1000倍）
10毫升肌醇储备液（100倍）
10克蔗糖
用1N KOH调整pH至5.7
7.5克Bacto琼脂
高压灭菌20-30分钟。
2. 愈伤组织诱导培养基（CIM，1升）
4.32克MS最小盐（Gibco）
0.5克MES
1毫升维生素储备液（1000倍）
10毫升肌醇储备液（100倍）
20克葡萄糖
1毫升IAA储备液（1000倍）
0.5毫升2,4-D储备液（2000倍）
0.5毫升细胞分裂素储备液（2000倍）
用1N KOH调整pH至5.7
7.5克Bacto琼脂
高压灭菌不超过20分钟。
3. B5培养基
Gamborg的B5培养基（Gibco）（含有最小有机物的基础培养基）
将一瓶的全部内容溶解以制备1升培养基
用1N KOH调整pH至5.7
7.5克Bacto琼脂。
4. 储备液：
肌醇（100倍）10毫克/毫升
维生素（1000倍）0.5毫克/毫升烟酸
0.5毫克/毫升吡哆醇
0.5毫克/毫升硫胺素-HCl
IAA（1000倍）5毫克/毫升溶于水中，适量加入KOH
2,4-D（2000倍）1毫克/毫升溶于水中，适量加入KOH
细胞分裂素（2000倍）0.6毫克/毫升溶于水中，适量加入KOH。
材料
（此处可根据实际需要添加材料清单）
提示
（此处可根据实际需要添加实验提示）