简介
DNA循环测序技术在基因组研究中具有重要意义，但传统方法存在反应条件依赖模板浓度的问题。本文介绍了一种基于Taq聚合酶的荧光终止子循环测序新方案，该方法对DNA浓度的敏感性较低，操作简便，适合高通量自动化平台应用。该技术利用荧光标记的终止子，减少了反应的复杂性，提高了测序的重现性和准确性，已成为现代基因测序的重要工具之一。
操作流程
- 将0.5微克单链DNA或1微克双链DNA加入0.2毫升的PCR管中。
- 加入1微升（单链模板）或4微升（双链模板）0.8微摩尔的引物，以及9.5微升ABI公司提供的预混液，最终体积用无菌水补足至20微升。
- 短暂离心后，按照制造商推荐的程序进行循环反应，包括预热至96°C，随后进行25个循环：96°C 15秒，50°C 1秒，60°C 4分钟，最后保持在4°C。
- 使用离心柱纯化反应产物，可选择Centri-Sep或G-50微孔板方法。
纯化步骤
采用Centri-Sep柱纯化：
- 轻轻敲击柱子，使凝胶沉淀到底部。
- 移除柱塞，加入0.75毫升去离子水，混匀并在室温下水合至少30分钟。
- 将柱子放入洗涤管中，离心1300g 2分钟，去除液体。
- 将柱子放入样品收集管中，加载反应混合物，避免油层污染。
- 再次离心，干燥样品，可选择乙醇沉淀以提高纯度。
采用Sephadex G-50微孔板纯化：
- 在Millipore 45微升柱加载器中加入干燥的Sephadex G-50树脂。
- 用多孔板和多通道移液器加入适量水，水合树脂并存放数周。
- 使用离心机将滤板与微孔板结合，离心去除多余缓冲液，纯化反应产物。
应用前景
该方法简化了测序流程，提升了操作效率和数据质量，已广泛应用于基因组测序和突变分析等领域。未来，结合自动化平台，有望实现更高通量和更低成本的基因测序解决方案。