描述

DNA连接是通过在缓冲液、rATP和T4 DNA连接酶（1,2）存在下，将DNA片段与适当线性化的克隆载体孵育来进行的。对于随机鸟枪法克隆，将经超声或雾化处理的片段与SmaI线性化、去磷酸化的双链M13复制型或pUC载体在4°C下孵育过夜进行连接。根据初始DNA的量确定一个实用的浓度范围，并使用该范围内的不同插入DNA量进行多次连接反应，以确定连接反应中合适的插入片段与载体比例。此外，还需进行若干对照连接反应，以测试平末端处理过程、连接反应效率以及载体质量（1,2）。这些对照通常包括在不含插入DNA的情况下进行平行连接，以确定因载体去磷酸化不充分而自连产生的背景克隆。同时，使用已知的平末端插入片段或插入文库（通常是粘粒的AluI酶切产物）进行平行连接，以确保平末端连接反应能够产生足够多的含插入片段的克隆，而不依赖于修复过程。

主要作者
Bruce A. Roe ( broe@ou.edu )

所属机构
美国俄克拉荷马大学

合著者
Judy S. Crabtree
Akbar S. Khan

操作步骤

1. 在微量离心管中混合以下试剂，并在4°C下孵育过夜：

DNA片段：100-1000 ng
克隆载体：2 μl (10 ng/μl)
10×连接缓冲液：1 μl
T4 DNA连接酶（NEB 202L）：1 μl (400 U/μl)
无菌ddH2O：补足至总体积
总体积：10 μl

克隆载体通常为SmaI线性化、CIAP去磷酸化的pUC载体（Pharmacia 27-4860-01），因为几年前我们从基于M13的鸟枪法克隆转向了基于pUC的克隆。从一个分离的鸟枪法亚克隆中获得两条序列读长的优势似乎超过了双链与单链读长相比少几个碱基的劣势。在某些情况下，在连接反应中加入5% PEG似乎也能略微提高连接效率。

2. 包括不含插入DNA的对照连接反应以及使用已知平末端插入片段（如AluI消化的粘粒）的对照连接反应。

配方

（原文无内容，保留空段）

试剂耗材

T4 DNA连接酶（NEB 202L）
pUC载体（Pharmacia 27-4860-01）

提示

（原文无内容，保留空段）