NGFR TaqI(a)多态性是神经生长因子受体(NGFR)基因第6外显子中的一个单核苷酸多态性(SNP),通过TaqI限制性内切酶进行基因分型。该多态性可能与神经退行性疾病、精神疾病等相关,是遗传关联研究中的常用标记。
实验步骤
模板:基因组DNA 100-200 ng/反应
引物:
正向引物(NGFRTQAF1):5' GAC ACT GGT TAT ACT CTA GTC C 3'(100 ng/反应)
反向引物(NGFRTQAR1):5' CAG TGG CTT GCA GAT GAT TC 3'(100 ng/反应)
dNTPs:终浓度200 μM每种
缓冲液:终浓度1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris HCl pH 8.4
Taq DNA聚合酶:0.5单位/反应(Perkin-Elmer Amplitaq DNA聚合酶 5 U/μl,货号 N808-0145)
PCR循环程序:
94°C 5分钟;
94°C 30秒,60°C 30秒,72°C 30秒,30个循环;
72°C 7分钟
产物大小与酶切:PCR产物长度为423 bp。经TaqI酶切后,杂合子产生82 bp和341 bp两个片段,而纯合子则保持423 bp(未切)或完全切为82 bp和341 bp。
注意事项:确保DNA质量良好,避免降解;PCR退火温度可根据引物Tm值优化;酶切反应需充分进行,建议37°C孵育至少1小时。