描述

本文详细介绍了在噬菌体展示技术中对抗体进行生物素化标记的实验步骤。生物素化是一种常用的蛋白质标记方法，通过将生物素共价连接到抗体上，使其能够被链霉亲和素等亲和分子捕获，广泛应用于免疫检测、亲和纯化和噬菌体展示筛选等研究领域。

实验步骤

1. 将10-50 μg的IgG抗体（参见提示2）移入硅化微量离心管中（参见提示3）。

2. 向IgG中加入4.4 μL的1 M NaHCO₃。

3. 加入足量ddH₂O使总体积达到39 μL（参见提示4）。

4. 将约1 mg的生物素化试剂溶解于2 mL的醋酸钠缓冲液中（参见提示5）。

5. 立即（参见提示6）向步骤3制备的抗体溶液中加入5 μL步骤4制备的溶液。

6. 室温下反应2小时（参见提示7、8）。

7. 加入500 μL的乙醇胺缓冲液。

8. 室温下继续反应2小时（参见提示9）。

9. 加入20 μL的透析BSA（参见提示10）。

10. 加入1 mL的TBS（参见提示11）。

11. 将样品移入Centricon 30超滤管中（参见提示12、13），按照制造商说明浓缩样品。

12. 用2 mL TBS洗涤保留物三次，以去除未结合的生物素。

13. 用TBS/0.02% NaN₃洗涤保留物一次。

14. 按照Centricon制造商说明，通过反向离心将保留物收集到锥形杯中。

15. 将保留物储存于500 μL离心管中，4°C保存。

16. 用微量移液器测量体积（参见提示14）；通常可获得50-80 μL。如需长期保存，加入等体积的超纯甘油，混合后于-20°C保存（参见提示15）。

试剂配方

TBS/0.02% NaN₃：在1× TBS中加入0.02% NaN₃。

TBS (1×)：50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl。室温保存，可高压灭菌。

透析BSA：50 mg/mL无生物素的牛血清白蛋白（BSA, Sigma），用ddH₂O配制，过滤除菌，-20°C保存。

乙醇胺缓冲液：1 M乙醇胺（注意！参见提示1），用HCl调pH至9，过滤除菌，4°C保存。

醋酸钠缓冲液：2 M醋酸钠，调pH至6。

生物素化试剂：NHS-LC-生物素（Pierce）。

1 M NaHCO₃：过滤除菌。

提示

1. 注意！乙醇胺是生物危害物质，请查阅其MSDS以获取正确处理说明。

2. 大多数水溶性靶标受体（配体）可替代IgG。

3. 可对更大量的蛋白质进行生物素化，其他组分的体积应相应增加以保持浓度相似。

4. 蛋白质溶液中不应含有除蛋白质本身外可能与试剂反应的一级或二级胺或其他基团。最终pH应在7-9之间。

5. 生物素化试剂的浓度约为0.9 mM。

6. 在水性缓冲液中，NHS酯的水解与生物素化反应竞争。尽管在pH 6时水解较慢（即使在碳酸氢钠缓冲液中），但溶解固体后不应延迟。

7. 生物素化试剂的最终浓度约为100 μM。

8. 本方案的贡献者发现（在另一项大规模实验中，使用终浓度为1 mg/mL [6.7 μM]的IgG，相对于生物素化试剂有15倍的摩尔不足），每个抗体分子约掺入6个生物素基团。此类抗体在生物淘选中有效。由于生物素化反应可能受竞争性水解反应限制，因此决定生物素化程度的是生物素化试剂的浓度（而非其与抗体的摩尔比）。贡献者因此预期即使IgG浓度较低（即230 μg/mL），也能达到相同的生物素化程度（约每个分子6个生物素）。

9. 乙醇胺与任何未反应的生物素化试剂反应，防止下一步添加的载体BSA被生物素化。

10. 当使用量大于或等于1 mg时，可省略载体BSA，从而可通过分光光度法量化生物素化蛋白的最终产量。

11. 后续步骤可在非硅化实验器皿中进行，因为BSA作为载体蛋白。

12. Centricon 30（Amicon）的分子量截留值为30 kDa。根据配体选择合适的Centricon 30，并按照制造商说明操作。

13. 本程序中的Centricon超滤管容量为1 mg。如果生物素化更大量的蛋白质，建议使用透析或其他更大的超滤管（例如Millipore的Ultrafree 15）以去除未反应的生物素并浓缩偶联物。

14. 贡献者假设无损失，计算生物素化蛋白的浓度。