描述

本方案描述了一种利用酚和冷冻处理从酵母细胞中提取总RNA的方法。该方法通过酚抽提去除蛋白质，并利用冷冻步骤促进细胞裂解和RNA释放，适用于酵母等微生物的RNA提取。

步骤

1. 培养10 ml酵母至5×10^6细胞/ml。

2. 离心收集细胞，重悬于400 μl AE缓冲液中。

3. 将细胞转移至1.5 ml微量离心管，加入40 μl 10% SDS，涡旋混匀。

4. 加入等体积酚，涡旋，65°C孵育4分钟。

5. 将管迅速置于干冰/乙醇浴中冷却，直至酚晶体出现，室温离心2分钟。

6. 将水相转移至新管，加入等体积酚/氯仿/异戊醇，涡旋，室温离心5分钟。

7. 将水相转移至新管，加入1/10体积的3M乙酸钠（pH 5.3）和2.5倍体积乙醇，-20°C沉淀20分钟。

8. 沉淀RNA，用80%乙醇洗涤，空气干燥沉淀，重悬于20 μl水中。

配方

（DEPC处理：加入DEPC至0.1%，混匀过夜，高压灭菌以破坏DEPC）

DEPC处理水

AE缓冲液（DEPC处理）：50 mM乙酸钠，pH 5.3；10 mM EDTA

10% SDS

用AE缓冲液平衡的酚

酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）

3M乙酸钠（pH 5.3，DEPC处理）

无RNase的95%乙醇（-20°C）

无RNase的80%乙醇

注意事项

所有溶液需使用DEPC处理水配制，并确保无RNase污染。操作过程中需佩戴手套，避免RNase污染。