描述

本方案详细描述了使用玻璃珠破碎法从酵母细胞中提取总RNA的步骤。该方法适用于对数生长后期的酵母培养物，可有效获得高质量RNA，用于后续分子生物学实验。

实验步骤

1. 在20 ml培养基中培养酵母细胞至对数生长后期（约1×10⁷个细胞），可根据需要按比例扩大或缩小培养规模。

2. 将细胞转移至50 ml Falcon管中，使用Beckman台式离心机3000 rpm离心5分钟。

3. 用DEPC处理水洗涤沉淀。

4. 再次3000 rpm离心5分钟。沉淀可在-70°C下长期保存。

5. 用0.6 ml RNA提取缓冲液重悬沉淀。

6. 立即加入等体积的PCI（苯酚:氯仿:异戊醇=50:50:1），混匀。

7. 室温静置5-6分钟。

8. 在此期间，将混合物转移至13×100 mm玻璃管中。

9. 加入玻璃珠至有机相弯月面约3/4处，最大速度涡旋2分钟。

10. 将溶液转移至1.5 ml微量离心管中，离心分离相。

11. 用PCI抽提水相2次，再用SEVAG（氯仿:异戊醇=24:1）抽提1次（每次加入等体积）。

12. 加入0.1体积（约40 μl）3M NaOAc（pH 5.2）和2-3倍体积的冷95%乙醇，-20°C沉淀1小时。

13. 离心沉淀，用70%乙醇洗涤沉淀。

14. 用DEPC处理水（约30 μl）重悬，-70°C保存。

试剂配方

DEPC处理水：用0.1% DEPC处理去离子水，高压灭菌。

RNA提取缓冲液：0.1 M NaCl（DEPC处理），10 mM EDTA（DEPC处理），5% SDS（DEPC处理），50 mM Tris-HCl（pH 7.5，不可DEPC处理）。

PCI：苯酚:氯仿:异戊醇=50:50:1（体积比）。

SEVAG：氯仿:异戊醇=24:1（体积比）。

3M NaOAc（pH 5.2）：DEPC处理。

无RNase的95%乙醇：-20°C预冷。

无RNase的70%乙醇：用DEPC处理水配制。

注意事项

所有溶液和器材需确保无RNase污染，操作过程中佩戴手套和口罩。玻璃珠使用前需用酸处理或DEPC处理以去除RNase。