本文详细描述了从酵母中纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白的实验步骤。GST融合蛋白纯化是一种常用的蛋白质纯化技术，利用GST标签与谷胱甘肽琼脂糖珠的特异性结合，实现目标蛋白的高效纯化。酵母系统因其真核表达环境，常用于表达需要翻译后修饰的蛋白。

实验步骤

1. 培养：在5 ml过夜培养的酵母菌液中，接种50 ml新鲜培养基，30°C振荡培养至OD600为0.8-1.2。对于SCD培养基，使用1/500和1/1500稀释度。可选：加入α因子至2.5 μM，继续振荡30°C培养60分钟。

2. 收集细胞：加入1 M NaN3至终浓度10 mM，将培养物置于冰上。后续所有操作需在低温下进行。3000 g离心10分钟，4°C。弃上清，用0.5 ml 10 mM NaN3重悬细胞，转移至1.5 ml微量离心管。再次3000 g离心10分钟，4°C（或8000 g离心1分钟，室温）。弃上清，可选：将沉淀冻存于-80°C。

3. 裂解：用1 ml冷10 mM NaN3重悬，测量OD600。调整体积使各样品细胞数相等，最佳总OD600为30。用1 ml裂解缓冲液洗涤，3000 g离心10分钟，4°C，弃上清。用400 μl裂解缓冲液重悬。

4. 破碎：取一勺玻璃珠加入0.5 ml PCR管，转移细胞悬液至PCR管。涡旋振荡1分钟，重复4次，期间保持样品低温。在管底扎孔，将细胞裂解液转移至新的微量离心管，1500 g（或500 × g）离心10分钟，4°C。将底部管中液体转移至新管，再次1500 g离心10分钟，4°C，转移上清。

5. 结合：加入Triton X-100至1.5%，4°C摇动60分钟。3000 g离心10分钟，4°C，转移上清至新管。取30 μl上清，加入30 μl 2× SDS-PAGE上样缓冲液，作为纯化前样品。剩余液体中加入100 μl 40%谷胱甘肽琼脂糖珠悬液，4°C混合2小时（过夜亦可）。谷胱甘肽珠需预先用PBS洗涤3次，再用裂解缓冲液洗涤1次，最后以40%悬液重悬于裂解缓冲液。

6. 洗涤：用含1% Triton X-100、300 mM NaCl的PBS洗涤谷胱甘肽珠5次，室温下2000 g离心5分钟。每次洗涤间摇动5分钟。首次洗涤后更换离心管以减少非特异性结合。

7. 洗脱：用SDS-PAGE上样缓冲液重悬珠子。可选：用1-2倍柱体积的5-10 mM还原型谷胱甘肽（溶于50 mM Tris pH 8）洗脱3次，洗脱液与6× SDS-PAGE上样缓冲液混合，再用SDS-PAGE上样缓冲液剥离珠子。100°C加热10分钟，-20°C保存。蛋白即可用于SDS-PAGE电泳。

裂解缓冲液配方（20 ml）

3.3 M三乙醇胺（pH 7.2）194 μl（终浓度40 mM），0.5 M EDTA（pH 8）80 μl（2 mM），5 M NaCl 600 μl（150 mM），0.1 M DTT 400 μl（2 mM），10 mM AEBSF 0.4 ml（0.2 mM），1.5 mg/ml亮抑酶肽200 μl（15 μg/ml），0.5 mg/ml胃蛋白酶抑制剂20 μl（20 μg/ml），1 M苯甲脒20 μl（1 mM），0.5 mg/ml抑肽酶400 μl（10 μg/ml），100 mM β-甘油磷酸20 μl（100 μM），50 mM原钒酸钠200 μl（0.5 mM），加水至20 ml。

注意事项

所有操作需在低温下进行，以保持蛋白活性。谷胱甘肽珠可重复使用，但需充分洗涤。若需高纯度蛋白，建议使用洗脱步骤而非直接煮沸。