描述

双杂交系统（Two-Hybrid System）是一种用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的分子生物学技术。本方案详细描述了利用酵母双杂交系统进行大规模文库筛选的实验步骤，包括酵母培养、转化、热激及筛选等关键环节。

实验步骤

1. 将含有第一个质粒的酵母菌株接种到适当体积的SC-缺失培养基中，于30°C振荡培养过夜。根据不同的规模（10X、30X、60X），培养体积分别为25 ml、50 ml、100 ml。

2. 测定细胞滴度，计算获得2.5×10^8个细胞所需的体积（对应每50 ml YPAD培养基）。对于10X、30X、60X规模，分别需要2.5×10^8、7.5×10^8、1.5×10^9个细胞，对应YPAD培养体积为50 ml、150 ml、300 ml。

3. 将计算好的培养体积转移至无菌离心管中，3000×g离心5分钟收集细胞。弃上清，用预温至30°C的YPAD重悬细胞沉淀，转移至新的无菌培养瓶中。对于10X、30X、60X规模，YPAD体积分别为50 ml、150 ml、300 ml。

4. 于30°C、200 rpm振荡培养3-4小时，直至细胞滴度达到2×10^7 cells/ml。

5. 3000×g离心5分钟收集细胞。用1/2体积的无菌去离子水重悬洗涤细胞，再次离心收集。

6. 用适当体积的100 mM无菌LiAc重悬沉淀，转移至离心管中，30°C孵育15分钟。再次离心去除上清。对于10X、30X、60X规模，LiAc体积分别为3 ml、3 ml、6 ml。

7. 按顺序向另一管中加入转化混合液组分（如下表），涡旋混匀。将转化混合液加入细胞沉淀中，剧烈涡旋重悬。也可先将除质粒DNA外的所有组分混合，加入细胞沉淀后再加质粒DNA混匀，以避免质粒DNA损失。

转化混合液组分（10X/30X/60X）：50% PEG 2.4 ml/7.20 ml/14.40 ml；1.0 M LiAc 360 μl/1.08 ml/2.16 ml；SS-DNA (2 mg/ml) 500 μl/1.50 ml/3.00 ml；文库质粒DNA A μl/B μl/C μl；无菌去离子水 340-A μl/1.02-B ml/2.04-C ml。

注意：各组分体积已按比例调整，其中SS-DNA用量为之前版本的两倍。

8. 剧烈涡旋细胞沉淀直至完全重悬（约1分钟）。若难以重悬，可静置5分钟后再涡旋。

9. 30°C孵育30分钟。

10. 42°C热激，时间根据规模而定：10X为30分钟，30X为40分钟，60X为45-60分钟。每5分钟颠倒混匀15秒以平衡温度。

11. 离心收集细胞，用适当体积的无菌去离子水重悬，涂布于SC-缺失培养基平板。对于30X和60X规模，通常涂布100个大平板（每板约400 μl重悬液）。10X规模用量较少。重悬体积：10X为10 ml，30X和60X为40 ml。

12. 对于利用HIS3基因进行遗传筛选的双杂交系统，可直接涂布于缺乏色氨酸、亮氨酸和组氨酸的SC-缺失培养基。通过涂布少量等分（1-2 μl）至缺乏Trp-Leu的平板来计算筛选的总转化子数。

13. 30°C培养3-5天，直至菌落出现。

配方

（原文未提供具体配方，建议参考标准酵母培养基配方）

耗材

（原文未列出具体耗材）

提示

1. 标准转化反应可放大至120倍，但通常无需如此大规模。

2. 使用塑料移液管转移PEG溶液，避免使用玻璃移液管，因PEG易附着于玻璃表面影响体积准确性。

3. 无菌去离子水和质粒DNA的体积可调整，但两者总体积需保持恒定。