描述

本方案详细描述了使用mTn-lacZ/LEU2对酵母基因进行穿梭诱变和表位标记的完整流程。穿梭诱变是一种高效的基因操作技术，通过转座子插入实现基因的随机突变和标记，适用于功能基因组学研究。

步骤

1. 穿梭诱变

将目标基因片段克隆至载体pHSS6（来自菌株R1123，图谱见下文）。尽可能删除多克隆位点，以避免转座子“热点”插入。转化至LB Kan40平板筛选。

将质粒转化至感受态细胞R1236/B211，在LB Kan40 Cm34平板上筛选。

通过与菌株B198接合转移F::mTn-lacZ/LEU2：将供体菌B198（含Amp50抗性）和受体菌B211分别过夜培养，次日1:100稀释至新鲜无抗培养基，37℃培养至早期对数期（可见细胞旋涡）。取200 μl各菌液混合，37℃静置20分钟至1小时，涂布100 μl至LB Amp50 Kan40 Cm34平板，30℃培养1-2天，获得共整合体。

2. 共整合体解离

将菌株R1230在Sm50中过夜培养。从平板上洗脱菌落：加入2 ml LB，用涂布器刮下菌落，获得洗脱液（应含数千菌落）。将R1230过夜培养物1:100稀释（无抗），洗脱液调至相近密度。混合后接合20分钟至1小时，涂布100 μl至LB Amp50 Kan40 Sm50平板，37℃过夜。对照：将起始菌株点种于该培养基。

3. 从解离菌株中拯救DNA

用LB洗脱菌落（应达数千），取部分洗脱液稀释至接近饱和密度，加Amp50和Kan40，37℃培养数小时。用碱裂解法小量制备DNA：使用150 μl 7.5M NH4Ac作为溶液III，270 μl异丙醇沉淀，可去除大部分蛋白质和RNA，获得干净的小沉淀。注意全程冰上操作以防核酸酶降解。

取约1/10小提产物转化至常规recA endA克隆菌株（如DH5α），涂布LB Amp50 Kan40平板。

4. 转化酵母并筛选LEU2

将全部转化子洗脱（目标数千个），再次小提制备DNA（可保存-70℃备用）。用NotI消化整个库的DNA，转化酵母，筛选lacZ融合子。

5. 酵母中筛选框内lacZ融合

将转化子点种至SC-leu平板。用Whatman 1A滤纸复制至SC-leu平板和含滤纸的SC-leu平板，30℃过夜。对于ade2菌株，培养基需含80 mg/l腺嘌呤，以免红色色素干扰X-gal结果。

将滤纸转移至9 cm玻璃培养皿盖中，置于含氯仿的15 cm玻璃培养皿内，熏蒸10-30分钟（具体时间需经验确定）。

将滤纸菌落面朝上置于X-Gal平板（120 μg/ml X-gal, 0.1 M NaPO4 pH7, 1 mM MgSO4, 1.6%琼脂），30℃孵育至2天。阳性融合子可从原始SC-leu平板回收，后续尽量维持LEU2选择压力，因为某些突变即使在杂合状态下也有害。

配方

（原文未提供具体配方，建议参考标准分子生物学手册）

材料

（原文未列出）

提示

（原文未提供）