描述
本方案详细描述了从mRNA合成双链cDNA的步骤，适用于构建cDNA文库。所有操作需戴手套，溶液需经DEPC处理或购买RNA专用试剂。
第一链cDNA合成
所需试剂：5× SuperScript RTase缓冲液（Gibco-BRL）、5mM甲基化dNTPs（Pharmacia，以5mdCTP替代dCTP）、100mM DTT（Gibco-BRL）、oligo dT引物/接头、[α-32P] dATP（~400Ci/mmol，Amersham或DuPont）、核糖核酸酶抑制剂（RNasin，Pharmacia）、无菌DEPC处理水、SuperScript RTase（或SuperScript II，Gibco-BRL）。
步骤：
- 将mRNA加热至70°C，10分钟，然后立即冰浴冷却。
- 在无菌无RNase的离心管中依次加入：8μL 5× SuperScript RTase缓冲液、8μL 5mM甲基化dNTPs、4μL 100mM DTT、2μL oligo dT引物/接头（4μg）、1μL [α-32P] dATP、1μL RNasin、5.5μL H₂O、10μL mRNA、0.5μL SuperScript逆转录酶（约100单位）。混匀，37°C孵育1小时，冰浴终止反应。取4μL用于分析第一链cDNA产物的产量和质量。
第二链cDNA合成
所需试剂：10× DNA聚合酶缓冲液（1M HEPES，pH7.6，40mM MgCl₂，2.5mM DTT，675mM KCl）、100mM DTT（Gibco-BRL）、5mM dNTPs（Pharmacia）、无菌纳米纯水、[α-32P] dATP（~400Ci/mmol）、RNase H（Gibco-BRL）、DNA聚合酶I（Pharmacia）、3M乙酸钠/100mM乙酸镁（pH5.2）、无水乙醇、80%乙醇。
步骤：在冰上向剩余36μL第一链cDNA反应产物中依次加入：40μL 10× DNA聚合酶缓冲液、15μL 100mM DTT、12μL 5mM dNTPs、293μL无菌水、1μL [α-32P] dATP、1μL RNase H（0.9单位）、2μL DNA聚合酶I（20单位）。充分混匀，14°C孵育1小时，然后室温（22°C）孵育1小时。冰浴终止反应。用等体积酚/氯仿和氯仿各抽提一次。加入40μL 3M乙酸钠/100mM乙酸镁（pH5.2）和1mL无水乙醇，-20°C过夜沉淀cDNA。室温13,000 rpm离心30分钟，小心用80%乙醇洗涤沉淀，真空干燥。将沉淀重溶于44.5μL无菌水中，取4μL用于分析cDNA产量和质量。剩余40.5μL可用于平末端处理。
配方
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耗材
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提示
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